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Plant ROS Research

Efecto de compuestos nitrogenados en la germinación y metabolismo antioxidante de semillas de guisante

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Alumnas: Patricia Navarro Parra, Sofía Macías Morillo y Raquel López Hernández.

Tutora: María José Nicolás (IES Floridablanca, Murcia

Responsables del CEBAS-CSIC: José A. Hernández y Pedro Díaz Vivancos

El Grupo de Biotecnología del CEBAS ha participado en la IV Edición del Proyecto IDIES con un trabajo sobre el efecto de algunos compuestos nitrogenados en la germinación de semillas de guisante. En concreto, se empleó el KNO3 y el KNO2 a diferentes concentraciones. Después de varios experimentos, comprobamos que el KNO2 no tenía efectos positivos sobre la germinación ni el crecimiento temprano de las plántulas de guisante, por lo que nos centramos en el KNO3.

¿Porqué usamos semillas de guisante? Desde los trabajos de Mendel, la planta de guisante se ha usado como organismo experimental para estudios de fisiología y bioquímica vegetal y genéticos. Durante las últimas décadas, se ha utilizado como planta modelo para estudiar la respuesta a diferentes estreses ambientales. Las legumbres, incluido el guisante, se consideran alimentos básicos por su aporte de proteínas, carbohidratos, fibra, minerales y vitaminas (Clemente y De Ron (2016).

El tratamiento de semillas con compuestos nitrogenados, como el KNO3, está ampliamente relacionado con una mayor tasa de germinación y el crecimiento temprano en diferentes especies vegetales (Shim et al, 2008; Ghobadi et al 2012; Vidal et al., 2017). El efecto del KNO3 sobre la germinación es dependiente de la concentración  y del modo de aplicación usados. Por otro lado, las especies reactivas del nitrógeno, como el óxido nítrico (NO), también están asociadas al proceso de germinación (Bethke et al., 2006; Diaz-Vivancos et al., 2013).

La capacidad de una semilla para germinar parece estar unida a la acumulación de un nivel crítico de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Bailly et al., 2008; Barba-Espín et al 2010; Díaz Vivancos et al. 2013). En este sentido, los mecanismos antioxidantes cumplen una función muy importante en el control de los niveles de ROS en la semilla durante el proceso de germinación (Barba-Espín et al 2010; Díaz Vivancos et al. 2013). Sin embargo, el efecto del KNO3 sobre el metabolismo antioxidante de las semillas y plántulas en crecimiento es muy escaso, existiendo muy poca información sobre el ciclo ASC-GSH completo.

El proceso de germinación está también influido por el metabolismo de algunas hormonas vegetales, destacando el ABA y las GAs. En semillas de Arabidopsis el KNO3 reduce los niveles de ABA al inducir el gen CYP707A2, implicado en la degradación de esta hormona, favoreciendo el proceso de germinación (Matakiadis et al., 2009). Sin embargo, el efecto del KNO3 sobre los niveles de GAs está muy poco estudiado. Se sabe que se requiere NO para la transcripción de los genes GA3ox1 y GA3ox2, implicados en la biosíntesis GAs activas (Sanz et al. 2015).

En un trabajo previo se ha descrito que tanto KNO3 como nitroprusiato sódico (SNP, un generador de NO) reducían los niveles de ABA y aumentaban los de GA4 en las plántulas en crecimiento. Este efecto podría estar mediado por NO, ya que los efectos se revertían al añadir un secuestrador de NO al medio (el cPTIO) (Vidal et al 2017).

En este trabajo hemos estudiado el efecto del KNO3, a diferentes concentraciones, sobre la germinación, el metabolismo antioxidante y los niveles de ABA y GAs en plántulas y cotiledones de guisante.

Los datos revelaron que la concentración de 0,25 mM de KNO3 favorecía la absorción de agua por parte de las semillas, siendo los datos un 12% mayor que las semillas control a los 4 días post-imbibición. En contraste, la concentración 40 mM de KNO3 reducía la absorción de agua en un 5,5% en el mismo periodo de tiempo Estos efectos se reflejaron en los datos de crecimiento de las plántulas. En este sentido, 0.25 mM KNO3 producía un incremento de un 14% en el peso fresco de las plántulas, mientras que la concentración 40 mM de KNO3 lo reducía en un 28%. Un efecto similar se observó en la longitud de las plántulas.

Figura abs agua

 

Figura 1.- Efecto del KNO3 sobre la tasa de absorción de agua en plántulas de guisante. Cada semilla se pesó antes de someterla a cualquier tratamiento (peso seco inicial, día 0), y se depositó sobre dos discos de papel de filtro colocados en el fondo de un vaso de plástico de 3,5 cm de diámetro. A continuación se le añadió un ml H2O destilada (control) o de los diferentes tratamientos. Las semillas se fueron pesando cada día en una balanza de precisión y se fue anotando el porcentaje de germinación. Para calcular la tasa de absorción de agua (en µmoles de H2O por gramo peso seco (DW) se usó la fórmula:

 

[(Wn-Wo)/Wo] * 1000; Wo, peso inicial de la semilla seca; Wn, peso de la semilla en día n

 

 

 

Figura 2.- Efecto del KNO3 sobre el crecimiento de plántulas de guisante

 

De forma paralela, estudiamos el efecto del KNO3 en los niveles de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos en las plántulas de guisante.

Respecto a los datos de ascorbato, detectamos sólo la forma reducida (ASC) pero no la forma oxidada (DHA). El KNO3 producía un descenso progresivo de los niveles de ASC. Este descenso era de un 50% y de un 73% en plántulas tratadas con 0,25 mM y 40 mM de KNO3, respectivamente. En estas últimas muestras detectamos la presencia de DHA, lo que daba lugar a un descenso del estado redox de ascorbato. Respecto al glutatión, observamos un efecto diferente dependiendo de la concentración de KNO3. La concentración más baja de KNO3 reducía los niveles de glutatión reducido (GSH) en un 33% y de glutatión oxidado (GSSG) en un 54% (Tabla 1). Sin embargo, el KNO3 40 mM  daba lugar a un aumento del GSH de un 14% y un descenso de GSSG de un 30%. En ambos casos, se observó un aumento del estado redox del glutatión.

Tabla 1

La información acerca del efecto del KNO3 sobre el metabolismo antioxidativo durante la germinación de semillas es escasa. En unos pocos trabajos se muestra información sobre algunas enzimas antioxidantes, como POX, SOD, APX o CAT, pero la información acerca del efecto del tratamiento de semillas con KNO3 sobre el ciclo ASC-GSH completo en plántulas es muy escasa. Respecto al efecto del KNO3 sobre la actividad de las enzimas antioxidantes, se pudo observar que la concentración más baja de KNO3 producía un fuerte aumento de las enzimas MDHAR, DHAR y GR y un ligero descenso de la actividad APX, no sufriendo modificaciones importantes las enzimas POX y SOD. Sin embargo, la concentración 40 mM de KNO3 provocaba un descenso importante de las actividades APX, MDHAR, POX y SOD, y un aumento de las enzimas DHAR y GR.

Tabla 2

Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas, observamos la aparición de tres bandas con actividad SOD: una Mn-SOD y dos Cu,Zn-SODs, denominadas I y II en orden de movilidad creciente. La isoenzima mayoritaria es la Mn-SOD, de localización mitocondrial y peroxisomal y la Cu,Zn-SOD I, de localización citosólica. Sin embargo, la Cu,Zn-SOD II, de localización cloroplastídica, era minoritaria, lo que resultaba lógico al tratarse de semillas incubadas en oscuridad.

Fig 3 PAGE

El efecto positivo del KNO3 0,25 mM sobre el crecimiento de las plántulas de guisante estaba totalmente correlacionado con un aumento de 6 veces de los niveles de GA1 en la plántula y de GA4 en el cotiledón y de descenso importante de ABA tanto en la plántula como en el cotiledón. Sin embargo, el efecto negativo del KNO3 40 mM sobre el crecimiento no era debido a un descenso de GAs, ya que los nieles de GA4 no se modificaron en la plántula ni en el cotiledón e incluso observamos un aumento de GA1 en la plántula de 1,8 veces con respecto al control. En este caso, este efecto era debido a un aumento del ABA en la plántula.

 

fig GAs

Fig. 4.- Efecto del KNO3 sobre los niveles de GAs en plántulas y cotiledonesen plántulas  de guisante

Fig ABA

Fig. 5. Efecto del KNO3 sobre la concentración del ABA en plántulas y cotiledones de guisante.

Fig Ratio ABA_GAs

Fig. 6. Efecto del KNO3 en el ratio ABA/GAs en plántulas y cotiledones de guisante.

 

Se ha establecido una correlación entre la biosíntesis de GAs y el óxido nítrico (NO). Es sabido que el NO regula la transcripción de los genes GA3ox1 y GA3ox2, claves en la biosíntesis de las GAs activas (Sanz et al. 2015). En este sentido, Vidal et al (2017) también observaron un aumento de GA4 en plántulas de guisante por efecto de la germinación en presencia de SNP o de KNO3 10 mM.

Por lo tanto, parece existir una relación estrecha entre el NO3-, la biosíntesis de NO, los niveles de ABA y GAs y los correspondientes efectos fisiológicos en la germinación de semillas y en el crecimiento temprano de las plántulas.

Como conclusión general, en este trabajo hemos mostrado que el KNO3, a bajas concentraciones estimula el crecimiento de plántulas de guisante, que puede ser explicado parcialmente por un aumento en la absorción de agua. Este efecto estaba correlacionado con un aumento de las actividades MDHAR, DHAR y GR, implicadas en el reciclaje del ascorbato, con el aumento de GAs y una disminución de ABA, dando lugar a un menor ratio ABA/GAs tanto en las plántulas como en los cotiledones. Como conclusión general, podemos decir que el KNO3 estimula el crecimiento temprano de plántulas, lo que podría permitir su uso para vigorizar semillas en viveros.

Agradecimientos: El IV Congreso IDIES fue financiado por la Fundación Séneca y las empresas Grupo BioMaster, Abiopep, Grontal S.L., Equilabo y Proquilab.

 

Bibliografía

Barba-Espín et al. (2010) Plant Cell Environm. 33:981-94

Clemente y De Ron (2016) La Legumbres, Colección Divulgación CSIC. Ed. Catarata, Madrid.

Bethke et al. (2006) J Exp Bot 57: 517–526.

Diaz-Vivancos et al (2013) Plant Cell Reports 32: 1491-1502.

Matakiadis et al. (2009) Plant Physiol 149:949–960.

Sanz et al. (2015) J. Exp. Bot. 66: 2857-2868.

Shim  et al.  (2008) HortScience 43, 2259-2262.

Vidal et al (2017) Plant Physiol. Biochem. (Trabajo en revisión).

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