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Plant ROS Research


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El sistema antioxidante de apoplasto y simplasto en plantas de cebolla: respuesta a largo plazo al estrés salino

En un trabajo reciente realizado en nuestro laboratorio, en cooperación con la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA, Venezuela) y la Universidad Técnica de Manabí (Ecuador), se ha estudiado la respuesta de los sistemas antioxidantes apoplásticos de raíz y de hojas de dos genotipos de cebolla (“Texas 502”, como sensible a salinidad y “Granex 429”,  como resistente) cultivadas en condiciones de salinidad.

Estos resultados formaron parte de la Tesis Doctoral de Grisaly García en la UCLA (Venezuela).

            Los datos de pérdida de electrolitos indicaron que la integridad de la membrana estaba afectada por el efecto de las sales, especialmente en la variedad “Texas 502” (Figura 1). En hojas, el daño provocado por la salinidad en las membranas era similar en ambos casos (Figura 1A). En las raíces, solo en el genotipo sensible a la sal, la pérdida de electrolitos aumentó fuertemente por el efecto del tratamiento de estrés, mostrando un aumento de 3.7 veces, en comparación con los valores  control (Figura 1B)

Fig 1
Figura 1. Pérdida de electrolitos (en%) de los tejidos de  raíz y foliares de dos genotipos de cebolla sometidos a estrés salino durante 20 días. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según el test de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. TxC (control “Texas 502”); TxS (“Texas 502”, sal estresado); GrC (control “Granex 429”); GrS (‘Granex 429’, estresado por sal).

            Detectamos actividad superóxido dismutasa (SOD) y peroxidasa (POX) en las fracciones apoplásticas de raíz y hoja de plantas de cebolla. La salinidad aumentó la actividad de SOD en simplasto de raíz en “Texas 502” y en las hojas de “Granex 429”. En contraste, la salinidad reducía la actividad de SOD en las fracciones apoplásticas de hojas y raíces de “Texas 502”, pero la actividad se mantenía en el apoplasto de “Granex 429”, resistente a salinidad (Figuras 2 y 3). En ‘Granex 429’, el estrés salino aumentó la actividad de la POX apoplástica de la hoja (Figura 4) y la actividad catalasa simpática (CAT) de ambos órganos (Figura 6), pero se produjo una disminución de la POX apoplástica de la raíz de “Texas 502” (Figura 4).

Fig 2
Figura 2. Efecto de la salinidad en la actividad SOD en  apoplasto de hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más información, ver Figura 1.
Fig 3
Figura 3. Efecto de la salinidad en la actividad SOD de simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más información, ver Figura 1.
Fig 4
Figura 4. Efecto de la salinidad en la actividad POX en el apoplasto de hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1.
Fig 5
Figura 5. Efecto de la salinidad en la actividad POX en simplasto de  hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1.
Fig 6
Figura 6. Efecto de la salinidad en la actividad CAT en simplasto de  hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1

            El estrés salino aumentó la actividad monodehidroascorbato reductasa (MDHAR) en simplasto de raíz y la hoja y en la glutatión reductasa GR en simplasto de la raíz, principalmente en ‘Granex 429’ (Figura 7 y 9). Sólo en esta variedad, resistente a salinidad, la actividad deshidroascorbato reductasa (DHAR) aumentó en simplasto de hoja (Figura 8). Por el contrario, la actividad GR disminuyó en simplasto de hoja sólo en “Texas 502”, sensible a salinidad (Figura 9).

Fig 7
Figura 7. Efecto de la salinidad en la actividad MDHAR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.
Fig 8
Figura 8. Efecto de la salinidad en la actividad DHAR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.
Fig 9
Figura 7. Efecto de la salinidad en la actividad GR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.

La salinidad aumentó los niveles de ascorbato reducido (ASC) en las hojas, y no se observó acumulación de deshidroascorbato (DHA) en las raíces en ambos casos. Estas respuestas aumentaron el estado redox del ascorbato, especialmente en las raíces (Tabla 1 y 2). En contraste, la salinidad disminuyó el glutatión reducido (GSH), pero se acumulaba el glutatión oxidado (GSSG) en las hojas, disminuyendo el estado redox del glutatión (Tabla 1 y 2). La salinidad aumentó ligeramente la concentración de GSH de raíz en el genotipo tolerante a la sal y no se modificó en el genotipo sensible. Sin embargo no se produjo acumulación de GSSG, lo que favoreció el aumento y / o mantenimiento del estado redox del glutatión (Tabla 1 y 2). Estos resultados sugieren que la menor sensibilidad a la sal en “Granex 429” podría estar relacionada con un mejor rendimiento de la maquinaria antioxidante en condiciones de salinidad.

Table 1
Tabla 1. Efecto de la salinidad en el contenido de ascorbato reducido (ASC) y oxidado (DHA) en raíces y hojas de dos genotipos de cebolla con diferente sensibilidad al estrés salino.
Table 2
Tabla 2. Efecto de la salinidad en el contenido de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en raíces y hojas de dos genotipos de cebollaon diferente sensibilidad al estrés salino.

            Además, la salinidad provocaba una mayor acumulación de radicales superóxido (O2.-) en las paredes celulares de la variedad sensible a salinidad, en relación a la variedad resistente (Figura 10B y 10D). Este resultado estaba correlacionado con el mayor nivel de actividad SOD en el apoplasto y en simplasto de hoja en la variedad resistente, con respecto a la variedad sensible (Figuras 2 y 3). La incubación de hojas  en presencia de MnCl2 10 mM evitó la tinción de O2.- (Fig. 10 E.), lo que indicaba la especificidad de la tinción de NBT. En este sentido, MnCl2 es un agente catalizador altamente eficaz de la dismutación  de radicales O2.-.

Fig 10
Figura 10. Efecto del estrés salino sobre la acumulación de radicales superóxido, detectado por tinción histoquímica con NBT, en hojas de las plantas de cebolla. (A) Control ‘Texas 502’; (B) Plantas ‘Texas 502’ tratadas con sal ; (C) Detalle de la imagen anterior (D) Control ‘Granex 429 ‘; (E) plantas ‘Granex 429 ‘  tratadas con sal; (F) Hojas de plantas ‘Texas 502’ tratadas con sal teñidas en presencia de MnCl2 10 mM.

            De hecho, debido a que el sistema radicular es el que primero percibe el estrés salino, las defensas antioxidantes apoplásticas de la raíz se mantenían o aumentaban en el genotipo resistente a la salinidad, en comparación con el genotipo sensible. Además, este efecto también se observó en las fracciones apoplásticas y simpláticas de las hojas, lo que sugiere un mejor control de la producción de O2.- y H2O2, así como una mayor capacidad de reciclaje de ASC y GSH en el genotipo tolerante a la sal. Estas respuestas podrían explicar la mejor respuesta a salinidad del genotipo de cebolla ‘Granex 429’.

Para más información: 

Grisaly García María; Clemente-Moreno M.José ; Díaz-Vivancos Pedro ;  García Marina; Hernández José A. (2020)The apoplastic and symplastic  antioxidant system in onion: Response to long-term salt stress. Antioxidants, Special Issue “Extracelullar Antioxidant Systems in Plants”. 9, 67. https://doi.org/10.3390/antiox9010067.


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Metabolismo antioxidante y fluorescencia de clorofila durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas micropropagadas de Stevia rebaudiana Bertoni

En un trabajo reciente, publicado por el grupo del Dr. José A. Hernández en cooperación con el Dr. Abel Piqueras, se ha comprobado que las enzimas antioxidantes, la fluorescencia de clorofila y los niveles de peroxidación lipídica (un parámetro de estrés oxidativo)  pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de plantas micropropagadas de stevia durante la aclimatación a condiciones ex vitro. Estos parámetros proporcionan información muy útil para monitorizar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada para la producción de edulcorantes y antioxidantes naturales para la dieta.

Plantas

Fases de la aclimatación de las plantas de stevia. A: Multiplicación; B: Enraizamiento: C: 2 dias aclimatación; D: 2 semanas aclimatación; E: 4 semanas aclimatación

Introducción

La aplicación de técnicas de cultivo in vitro es una poderosa herramienta de proliferación vegetativa para muchas especies vegetales [Van-Huylenbroeck et al 2000]. Sin embargo, este proceso puede limitarse debido a pérdidas significativas durante la aclimatación a condiciones ex vitro. La mejora de la actividad fotosintética es un paso crítico para alcanzar una alta tasa de supervivencia durante la aclimatación de las plántulas in vitro [Carvalho et al 2001]. En otras palabras, la activación adecuada de la fotosíntesis es el punto clave para cambiar la forma de adquirir carbono de fuentes heterotróficas o mixotróficas (condiciones in vitro) a fuentes autotróficas (condiciones ex vitro). Las plantas micropropagadas son muy susceptibles a las condiciones ambientales después de la transferencia a condiciones ex vitro. Por ejemplo, las plantas ex vitro normalmente están expuestas  a una mayor intensidad luminosa que las plantas cultivadas en condiciones in vitro. Además, la humedad relativa (HR) también es menor en condiciones ex vitro, por lo que las plantas son propensas a sufrir desecación durante la aclimatación. Ambos fenómenos, que contribuyen al daño por fotoinhibición y al estrés hídrico, pueden inducir la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, las plantas cuentan con un mecanismo eficiente de defensa antioxidante para defenderse de los efectos nocivos de ROS. Estas defensas incluyen las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (ASC-GSH) (ascorbato peroxidasa (APX), monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), deshidroascorbato reductasa (DHAR) y glutatión reductasa (GR)) y enzimas captadoras de ROS (superóxido dismutasas (SOD), peroxidasas (POX) y catalasa (CAT). El conocimiento sobre el comportamiento de la maquinaria antioxidante durante la aclimatación ex vitro es muy escaso, y solo unos pocos investigadores han estudiado los cambios en los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos durante este proceso [Van-Huylenbroeck et al 2000; Carvalho et al 2006; Dewir et al 2015; El-Mahrouk et al 2016].

La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es un arbusto perenne perteneciente a la familia Asteraceae. Las hojas de S. rebaudiana contienen una alta concentración de esteviol glucósidos, siendo las formas prevalentes el esteviósido y el rebaudiósido A, empleados como edulcorantes naturales como sustitutos de la sacarosa [Zeng et al 2006]. Sin embargo, las semillas de stevia tienen poca viabilidad y la planta requiere condiciones específicas de humedad, luz y nutrientes. La acumulación de esteviol glucósidos en S. rebaudiana es muy variable debido a la variabilidad genética. El contenido total de esteviol glucósidos es diferente no solo entre plantas del mismo cultivar, sino también entre plantas similares en la misma etapa de desarrollo [Ceunen et al 2007]. Además, se ha observado una alta capacidad antioxidante de los extractos de hojas de S. rebaudiana, relacionados con su función como captadores de ROS [Ceunen et al 2007; Ghanta et al 2007). Estas funciones positivas se han asociado principalmente con la presencia de compuestos fenólicos [Ceunen et al 2007]. Además, se han descritos efectos positivos del esteviósido relacionados con la diabetes tipo II, la hipertensión, el síndrome metabólico y la aterosclerosis [Ceunen et al 2007]. Por lo tanto, la producción de plantas clonales in vitro con un perfil de esteviósido similar puede ser de interés comercial.

En consecuencia, este trabajo se ha centrado en la aclimatación a las condiciones ex vitro de clones de stevia, originada a partir de la micropropagación de plantas previamente caracterizadas como altos acumuladores de esteviol glucósidos [Cantabella et al 2017]. Durante el proceso de aclimatación, se siguió la evolución de diferentes parámetros, incluido el metabolismo antioxidante, la peroxidación lipídica como parámetro de estrés oxidativo y la fluorescencia de clorofila, para determinar el estrés oxidativo que las plantas de stevia podrían estar sufriendo durante el proceso antes mencionado.

Resultados y Discusión

Durante las primeras horas del proceso de aclimatación, las plantas de stevia parecían experimentar estrés debido a la modificación de las condiciones de cultivo, como se observa por el aumento en los niveles de peroxidación lipídica, medidos como TBARS. En ese sentido, se detectó un pico después de 2 días, aumentando en un 86% con respecto a los valores en la plántula (Figura 1). Posteriormente, y a medida que avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro, los valores de peroxidación lipídica disminuyeron progresivamente hasta alcanzar los valores iniciales (Figura 1). Por lo tanto, se produjo un estrés oxidativo durante las primeras horas de aclimatación, indicando un posible daño a las membranas como consecuencia del cambio de condiciones de cultivo.

Fig 1

Fig 1. Datos de peroxidación de lípidos durante la aclimatación de plantas de stevia

Respecto al comportamiento de las enzimas antioxidantes,   observamos una actividad menor de la enzima monodehidroascorbato reductasa (MDHAR) que la enzima dehidroascorbato reductasa (DHAR) después de 2 días de aclimatación. Sin embargo, después de 7 días de aclimatación, las plantas de stevia activaron la ruta MDHAR para reciclar el ascorbato, que es mucho más eficiente, desde un punto de vista energético, que la ruta DHAR (Figura 2).

Fig 2

Figura 2. Evolución de las enzimas del ciclo ASC-GSH durante el procesod e aclimatación de plantas de stevia

En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, la relación DHAR / MDHAR era casi 2. Esto sugiere que, en esa etapa, la actividad de DHAR era la vía predominante en el reciclaje de ascorbato en plantas de stevia, utilizando GSH como donante de electrones. Posteriormente, DHAR disminuyó y MDHAR aumentó progresivamente, alcanzando una relación DHAR / MDHAR de 0.22 después de 28 días de aclimatación, donde la actividad de MDHAR fue casi 5 veces mayor que la actividad de DHAR. Por lo tanto, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia utilizaron la forma MDHAR, empleando NADH como poder reductor. Es necesario aclarar que la utilización de NADH para reciclar el ASC es más eficiente energéticamente que el uso de GSH. Por lo tanto, se pueden especular diferentes posibilidades para explicar la mayor actividad de DHAR en condiciones in vitro y después de 2 días de aclimatación. La primera es que, en condiciones in vitro, los medios de cultivo contenían sacarosa, por lo que las plantas tenían suficiente fuente de carbono para generar energía a través de la glucólisis y de la respiración, y por lo tanto pueden permitirse el uso de GSH para reciclar ASC (la “forma ineficiente”). La segunda posibilidad es que después de 2 días del proceso de aclimatación, las plantas sufrieron un estrés oxidativo, según los datos de peroxidación lipídica. Dado que la sobreexpresión de DHAR se ha asociado con la tolerancia al estrés ambiental [Eltayeb et al 2006], la mayor actividad de DHAR observada en esta etapa podría tener una función para hacer frente al estrés resultante de las condiciones de aclimatación. La tercera explicación está relacionada con el papel de DHAR en el crecimiento y desarrollo de las plantas [Potters et al 2012]. Probablemente, después de 2 días de aclimatación, el aumento de DHAR podría tener una función en los procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas. También observamos que la actividad de MDHAR aumentó después de 7 días de aclimatación. En esta etapa, la fotosíntesis parecía funcionar correctamente, como lo observan los valores de fluorescencia de clorofila y ETR. Por lo tanto, a partir de ese momento, las plantas produjeron sus propios azúcares y energía para apoyar el crecimiento de las plantas. Probablemente, por esta razón, las plantas cambiaron la forma de reciclar el ascorbato de una manera eficiente, a través de NADH.

La actividad GR se comportó de manera similar a la actividad MDHAR. En ese sentido, GR aumentó a medida que avanzó el proceso de aclimatación de las plantas, alcanzando sus valores máximos después de 21 y 28 días de aclimatación (incrementos de 4.2 y 3.2 veces, respectivamente) (Figura 2).

Las actividades superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) mostraron un pico de actividad después de 7 días de aclimatación (Figura 3), lo que sugiere una protección contra las ROS (especies reactivas de oxígeno) que se podrían estar generando como consecuencia del cambio de cultivo in vitro a ex vitro. La actividad peroxidasa (POX) aumentó aproximadamente 2 veces después de 2 días de aclimatación y permaneció alta hasta el día 14 (Figura 3), probablemente relacionada con el endurecimiento de la pared celular y los procesos de lignificación.

Fig 3

Figura 3. Evolución de las enzimas SOD, CAT y POX durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Después de 2 días de aclimatación, las plantas mostraron valores más altos de los parámetros de quenching no fotoquímico [Y (NPQ), Y (NO), NPQ y qN] y valores bajos de los parámetros de quenching fotoquímico [Y (II), qP] (Figura 4), así como de la velocidad de transporte de electrones (ETR) (Figura 5). Durante el proceso de aclimatación, se observó una disminución progresiva en los parámetros de quenching no fotoquímicos y un aumento constante en los parámetros de quenching fotoquímico. En ese sentido, Y (NPQ) disminuyó progresivamente, reduciendo sus valores en un 40% y 50% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). Paralelamente, Y (NO) disminuyó durante el ensayo de aclimatación, alcanzando una disminución cercana al 40% y 30% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). NPQ muestra aumentos y disminuciones durante el proceso de aclimatación. Al principio, después de 7 días de aclimatación, este parámetro aumentó en un 22%. Luego, el valor NPQ aumentó en un 63% después de 14 días de aclimatación en relación con el valor precedente (día 7). Una semana después (día 21), nuevamente el valor NPQ aumentó en un 29% en comparación con el valor observado en la segunda semana (14 días). Finalmente, después de 28 días de aclimatación, se observó una disminución del 30% en el parámetro NPQ en relación con el valor observado después de 21 días (Fig. 4). Sin embargo, aunque los valores de qN disminuyeron durante el proceso de aclimatación, los cambios producidos no fueron estadísticamente significativos (Figura 4). Tanto NPQ como Y (NPQ) están relacionados con la energía disipada como calor por un mecanismo regulado (es decir, el ciclo de xantofila) [Zhang et al 2012]. En contraste, Y (NO) refleja la fracción de energía disipada pasivamente como calor y fluorescencia, principalmente debido a los centros de reacción del PSII cerrados. Por lo tanto, los valores altos de Y (NO) están relacionados con la incapacidad de las plantas para protegerse del exceso de luz. En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia mostraron los valores más altos de Y (NO), que disminuyeron progresivamente durante el proceso de aclimatación, lo que refleja una mejor regulación [Klughammer et al 2008]. Por otro lado, valores altos de los parámetros de quenching no fotoquímicos indicaban que las plantas estaban sufriendo un estrés. Sin embargo, a medida que la planta se adaptaba a las nuevas condiciones ex vitro, estos parámetros disminuyeron.

Fig 4

FIgura 4. Evolución de los parámetros de fluorescencia de clorofilas durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Con respecto a los parámetros de quenching fotoquímico (Y (II) y qP), se produjo un aumento progresivo durante la aclimatación. En ambos casos, los valores aumentaron cerca de 3 veces después de 7 y 14 días de aclimatación, y aproximadamente 5 veces después de 21 y 28 días del proceso (Figura 4). Fv / Fm mostró los valores más bajos después de 2 días de aclimatación. Este parámetro aumentó después de 7 y 14 días, y luego disminuyó ligeramente después de 21 y 28 días de aclimatación, pero sus valores permanecieron estadísticamente más altos que los valores iniciales (Tabla 1). Los cambios observados en Y (II) y qP se correlacionaron con la evolución de los valores de ETR, alcanzando un aumento de casi 6 veces al final (28 días) del proceso de aclimatación (Figura 5). Esta respuesta de los parámetros de fluorescencia de clorofilas indicaba una mayor eficiencia fotosintética conforme avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro.

Fig 5

Figura 5. Evolución de la tasa de transporte electrónico durante el proces de aclimatación de plantas de stevia

Conclusiones

En conjunto, los datos sugirieron que las enzimas antioxidantes, la peroxidación lipídica y los parámetros de fluorescencia de clorofila pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de las plantas micropropagadas durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas de stevia, proporcionando información muy útil para controlar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación. Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada de edulcorantes y antioxidantes naturales para una dieta sana.

Para más información:

José Ramón Acosta-Motos, Laura Noguera Vera, Gregorio Barba-Espín, Abel Piqueras, José A. Hernández (2019) Antioxidant metabolism and chlorophyll fluorescence during the acclimatisation to ex vitro conditions of micropropagated Stevia rebaudiana Bertoni plants. Antioxidants, Special Issue “Antioxidants and Foods”, 8, 615.  (https://www.mdpi.com/2076-3921/8/12/615)

 

Bibliografía

Cantabella, D.; Piqueras, A.; Acosta-Motos, J.R.; Bernal-Vicente, A.; Hernandez, J.A.; Diaz-Vivancos, P. Salt-tolerance mechanisms induced in Stevia rebaudiana Bertoni: effects on mineral nutrition, antioxidative metabolism and steviol glycoside content. Plant Physiol. Biochem. 2017, 115, 484–496.

Carvalho, L.C.; Osorio, M.L.; Chaves, M.M.; Amâncio S. Chlorophyll fluorescence as an indicator of photosynthetic functioning of in vitro grapevine and chestnut plantlets under ex vitro acclimatization. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2001, 67, 271–280.

Carvalho, L.C.; Vilela, B.J.; Vidigal, P.; Mullineaux, P.M.; Amâncio, S. Activation of the ascorbate-glutathione cycle is an early response of micropropagated Vitis vinifera L. explants transferred to ex vitro. Int. J. Plant Sci. 2006, 167, 759-770.

Ceunen, S.; Geuns, J.M.C. Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1201−1228.

Dewir, Y.H.; El-Mahrouk, M.E.; Al-Shmgani, H.S.; Rihan, H.Z.; Teixeira da Silva, J.A.; Fuller, M.P. Photosynthetic and biochemical characterization of in vitro-derived African violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl) plants to ex vitro conditions. J. Plant Interact. 2015, 10, 101-108.

El-Mahrouk, M.E.; Dewir, Y.H.; Murthy, H.N.; Rihan, H.Z.; Al-Shmgani, H.S.; Fuller, M.P. Effect of photosynthetic photon flux density on growth, photosynthetic competence and antioxidant enzymes activity during ex vitro acclimatization of Dieffenbachia cultivars. Plant Growth Regul. 2016, 79, 29–37.

Eltayeb, A.E.; Kawano, N.; Badawi, G.H.; Kaminaka, H.; Sanekata, T.; Morishima, I.; Shibahara, T.; Inanaga, S.; Tanaka, K. Enhanced tolerance to ozone and drought stresses in transgenic tobacco overexpressing dehydroascorbate reductase in cytosol. Physiol. Plant. 2006, 127, 57–65.

Ghanta, S.; Banerjee, A.; Poddar, A.; Chattopadhyay, S. Oxidative DNA Damage Preventive Activity and Antioxidant Potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a Natural Sweetener. J. Agr.Food Chem. 2007, 55, 10962-10967.

Klughammer, C.; Schreiber, U. Complementary PSII quantum yields calculated from simple fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the saturation pulse method. PAM Application Notes (PAN) 2008, 1, 27-35

Potters, G.; Horemans, N.; Caubergs, R.J.; Asard, H. Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension. Plant Physiol. 2012, 124, 17-20.

Van-Huylenbroeck, J.M.; Piqueras, A.; Debergh, P.C. The evolution of photosynthetic capacity and the antioxidant enzymatic system during acclimatization of micropropagated Calathea plants. Plant Sci. 2000, 155, 59-66.

Zeng, J.; Cheng, A.; Lim, D.; Yi, B.; Wu, W. Effects of salt stress on the growth, physiological responses, and glycoside contents of Stevia rebaudiana Bertoni. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5720-5726.

Zhang, Q.Y.; Wang, L.Y.; Kong, F.Y.; Deng, Y.S.; Li, B.; Meng, Q.W. Constitutive accumulation of zeaxanthin in tomato alleviates salt stress-induced photoinhibition and photooxidation. Physiol. Plant. 2012, 146, 363–373.

 


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El Grupo de Biotecnología de Frutales del CEBAS-CSIC galardonado con el primer premio de la Academia de Ciencias de la Región de Murcia

El pasado 9 de Enero de 2020, la Academia de Ciencias de la Región de Murcia, entregó los premios a los mejores proyectos de investigación presentados en el VI Congreso IDIES.

Dos proyectos realizados en el CEBAS-CSIC resultaron galardonados con el primer premio, siendo ambos dirigidos por investigadores del Grupo de Biotecnología de Frutales del CEBAS-CSIC.

Uno de los trabajos, titulado “Efectos de la introducción de un gen de floración temprana de varias especies en plantas de Nicotiana tabacum L.”, fue realizado por los estudiantes Pablo Marín Martínez y Carmen Mª Sánchez Abenza, (IES Infante don Juan Manuel). La dirección científica corrió a cargo de la Dra Nuria Alburquerque Ferrando y la coordinación académica por el profesor D. Carlos Lopesino Vega. El objetivo principal de este trabajo fue la introducción de un gen de floración temprana procedente de tres especies vegetales (chopo, manzano y Arabidopsis) en la planta del tabaco (Nicotiana tabacum L.), utilizando como vector la bacteria Agrobacterium tumefaciens, para observar el efecto de la expresión de estos genes sobre el crecimiento de las plantas in vitro.

foto Nuria

La Dra. Nuria Alburquerque junto a los alumnus Pablo Marín Martínez y Carmen Mª Sánchez Abenza y el professor Carlos Lopesino

El otro proyecto premiado con el primer premio, titulado “Desarrollo de un sistema electrónico para la medida de la fluorescencia de clorofilas en plantas” fue llevado a cabo por los estudiantes Jorge Parra García y Jordi Germán Calle León (IES Alcántara de Alcantarilla), siendo dirigido por el Dr. José A. Hernández (CEBAS-CSIC) y el Dr. Juan Suardiaz (UPCT). En este proyecto, que constaba con una parte biológica y una parte técnica, se desarrolló un sistema electrónico de bajo coste basado en Arduino, que permitía detectar la emisión de fluorescencia de clorofilas en plantas sometidas a estreses ambientales, comparando los resultados con un equipo profesional que normalmente se usa en laboratorio. La profesora Dº Teresa de Jesús García Martínez fue la responsable de la coordinación académica.

Pepe1

El Dr. José A. Hernández y el Dr. Juan Suardiaz, junto a los estudiantes Jorge Parra y Jordi Germán Calle.


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Mandelonitrile-associated salicylic acid biosynthesis in peach under abiotic and biotic stresses

Diaz-Vivancos P; Bernal-Vicente A; Petri C; Cantabella D; Hernández JA

(Poster presented at the SMPR2019 congress (Valencia, 10-11 December 2019)

Abstract

Even though that salicylic acid (SA) is a key regulator of plant stress responses and other biological processes, its biosynthetic pathways have not been fully characterized. The proposed SA synthesis originates from chorismate by two distinct pathways: isochorismate and phenylalanine (Phe) ammonia-lyase (PAL) pathways. Cyanogenesis is the process related to the release of hydrogen cyanide from endogenous cyanogenic glycosides (CNglcs), and it has been linked to plant plasticity improvement. The main CNglcs in peach are prunasin and amygdalin, with mandelonitrile (MD), synthesized from Phe, controlling their turnover.

Using [13C]-labelled compounds and metabolomic analysis, we showed that MD, and hence CNglcs turnover, is involved, at least in part, in SA biosynthesis in peach plants. MD-treated peach plants displayed increased SA levels via benzoic acid (one of the SA precursors within the PAL pathway). Moreover, MD treatment modulated the H2O2 levels and had a pleiotropic effect on abscisic acid (ABA) and jasmonic acid (JA) levels (data not shown). Under the stress conditions, however, the contribution of this SA biosynthetic pathway from MD to the total SA pool does not seem to be important. Nevertheless, MD treatment not only increased SA levels, but also improved peach plants performance under the stressful conditions. In fact, MD provided partial protection against Plum pox virus (PPV) infection and stimulated the accumulation of phytotoxic ions in roots in PPV- and NaCl-stressed peach seedlings respectively.

Thus, we proposed a third pathway, alternative to the PAL pathway, for SA synthesis in peach plants, linking SA biosynthesis and cyanogenesis (Fig. 1). This proposed pathway seems to be functional under stress conditions, although the fact that CNglcs may be operating more broadly than by influencing SA pathways and signaling con not be ruled out.

Material and Methods

Plant material

The assays were performed on GF305 peach (Prunus persica L.) plants, under both greenhouse and in vitro conditions. For ex vitro assays, after submitting the GF305 peach seedlings to an artificial rest period in a cold chamber to ensure uniformity and fast growth, seedlings were grown in 2-L pots in an insect-proof greenhouse and distributed into three batches (control and MD- and Phe-treated) of 15 plants each. Plants were irrigated twice per week with water (control) and 1 mM MD or 1 mM Phe for 7 weeks. None of the treatments affected plant growth and development. For in vitro assays [13C]-labeled compounds were used, and 200 mM MD- or Phe-alpha[13C] (Campro Scientific GmbH, Germany) was added to the micropropagation medium during two subcultures. This concentration was selected after carrying out a preliminary assay using concentrations of both compounds ranging from 50 to 1000 mM; 200 mM was the highest concentration that did not show any deleterious effect on the development of micropropagated peach shoots.

Metabolomic analysis

The levels of Phe, MD, amygdalin, BA and SA were determined in in vitro micropropagated shoots at the Metabolomics Platform at CEBAS-CSIC (Murcia, Spain).

SA levels in peach seedlings

The SA levels in leaves of GF305 seedlings treated with MD or Phe were determined using a UHPLC-mass spectrometer (Q-Exactive, ThermoFisher Scientific) at the Plant Hormone Quantification Platform at IBMCP (Valencia, Spain).

Extraction and enzymatic assays

The activities of ascorbate peroxidase (APX),  peroxidase (POX), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in in vitro shoots and ex vitro leaf samples were assayed as described in Diaz-Vivancos et al. (2017) and Bernal-Vicente et al. (2018; 2019).

Results

FIG 1

Fig. 1. Proposed salicylic acid (SA) biosynthetic pathway in peach plants. Blue arrows indicate the SA biosynthesis in plants described previously. The dotted arrow indicates a putative pathway. Red arrows show the new pathway suggested for peach plants. CYP79 and CYP71, Cyt P450 monooxygenases; MDL1, mandelonitrile lyase.

FIG 2

Fig. 2. Percentage (of total amount detected) of [13C]- phenylalanine (Phe), mandelonitrile (MD) and salicylic acid (SA) in non-stressed, NaCl-stressed and Plum pox virus (PPV)-infected peach shoots micropropagated in the presence or absence of [13C]MD or [13C]Phe. Ions with an additional 1.0035 accurate mass and confirmation by isotopic distribution and spacing were defined as ions marked with 13C. Data represent the mean of at least 20 repetitions of each treatment.

FIG 3

Fig. 3 Total levels (mMg–1 FW) of amygdalin, benzoic acid, mandelonitrile, phenylalanine and salicylic acid, and mandelonitrile lyase (MDL) enzymatic activity in micropropagated peach shoots in the presence or absence of [13C]MD or [13C]Phe. Data represent the mean ± SE of at least 12 repetitions of each treatment. In each graph different letters above the columns indicate significant differences according to Duncan’s test (P< 0.05).

FIG 4

Fig. 4. Total SA level (ng g–1 DW) in the leaves of peach seedlings grown in the presence or absence of MD or Phe submitted to 34 mM NaCl (A) or PPV infection (B). Data represent the mean ± SE of at least five repetitions of each treatment. Different letters indicate significant differences according to Duncan’s test (P≤0.05).

Fig-5

Fig. 5. Summary of the differential response of MD treatment in salt-stressed and PPV-infected peach seedlings. Data from Diaz-Vivancos et al. (2017) and Bernal-Vicente et al. (2018; 2019).

TABLE 1

Table 1.- Effect of MD and Phe on H2O2-scavenging activities (APX, POX, CAT)  and SOD (H2O2-producing) activity in GF305 micropropagated shoots and seedlings. APX is expressed as nmol min-1 mg-1 protein. POX and CAT are expressed as µmol min-1 mg-1 protein. SOD as U mg-1 protein. Data represent the mean ± SE of at least four repetitions. It has been previously described that SA led to H2O2 accumulation (Durner & Klessig 1995; Rao et al. 1997).

Conclusions

We provide strong  evidences showing that CNglcs turnover is involved, at least in part, in SA biosynthesis in peach plants under control and stress conditions.

MD seems to act as a hub controlling the CNglcs turnover and the SA and amygdalin biosynthesis. MD-treated peach plants displayed increased SA levels via benzoic acid (one of the SA precursors within the PAL pathway).

We have also found evidence that this new SA biosynthetic pathway also works also under stress conditions. MD treatment improved the plant performance of peach plants under salinity or PPV-infection conditions. However, the contribution of this pathway to the SA pool does not seem to be relevant under these stress conditions.

MD also modulated the content in other stress related hormones as well as the antioxidant defenses, that could activate different redox-related signaling pathways.

Our data agrees with the previously reported role for CNglcs in oxidative stress tolerance (Gleadow & Møller 2014; Gleadow et al. 2016).

References

  • Diaz-Vivancos et al (2017) Plant & Cell Physiology 58(12): 2057–2066
  • Durner J and Klessig DF (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 92(24): 11312-11316
  • Bernal-Vicente et al (2018) Plant Biology 20(6):986-994
  • Bernal-Vicente et al (2019) Plant Biology DOI: 10.1111/plb.13066
  • Gleadow Møller (2014) Annual Review of Plant Biology 65:155–185
  • Gleadow et al (2016) Journal of Experimental Botany 6:403-5413
  • Rao et al (1997) Plant Physiology 115:137–149.

 

This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects AGL2014-52563-R; RTA2017-00011-C03-02).


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Oferta contrato predoctoral FPU 2019

Interesados en solicitar Beca FPU para realizar Tesis Doctoral en el CEBAS-CSIC, contactar con:

José A. Hernández Cortés (jahernan@cebas.csic.es).

 

RESUMEN PROYECTO DE TESIS

Efecto de la climatología invernal y la disponibilidad de agua de riego en los mecanismos antioxidantes y en la productividad del albaricoquero y el melocotonero en la Región de Murcia en un contexto de cambio climático

En las condiciones ambientales de nuestro entorno, de los cuatro grandes factores limitantes del crecimiento de las plantas, temperatura, luz, nutrientes y agua, es esta última el principal condicionante. El estrés hídrico es uno de los factores ambientales que más limita el crecimiento, desarrollo y la producción vegetal. También, muchas otras situaciones de estrés ambiental, como salinidad, altas temperaturas o heladas tienen un componente de estrés. Las plantas sufren cambios morfológicos y metabólicos significativos en respuesta a la sequía. Muchos de estos cambios parecen ser respuestas adaptativas mediante las cuales las plantas hacen frente al estrés ambiental. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de los mecanismos bioquímicos que sustentan estas respuestas.

El objetivo del proyecto es el realizar un seguimiento a variedades de albaricoquero y melocotonero representativas de ambas cultivos en la región de Murcia, cultivadas en diferentes localizaciones geográficas y sometidas a situaciones de riego diferencial.

Se añade en el estudio, 2 variedades cultivadas en condiciones de sombreo (malla protectora antigranizo) y en ausencia de la misma, con el fin de evaluar el efecto de la alta intensidad luminosa / radiación en las necesidades hídricas. Se pretende dar recomendaciones a los agricultores en lo referente al manejo integrado de ambos cultivos.

Los ensayos comenzarán desde el momento en que produce la inducción floral (en las condiciones de Murcia, después de que los agricultores recolecten la fruta), cerrando el ciclo en la cosecha del año siguiente. Cada 2-3 semanas se analizará el estado de humedad del suelo y el potencial hídrico de las hojas. Igualmente se tomarán muestras de hoja para analizar el estado de estrés de los árboles, mediante la medida del nivel de peroxidación de lípidos, para el análisis de los contenidos de clorofila y para el análisis de las principales enzimas antioxidantes.

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Ranking de Investigadores en Murcia y en España

A pesar de que la mayor parte de mi vida científica he sido un grupo prácticamente unipersonal, es de destacar el hecho de ocupar el puesto 29 de los investigadores más citados de la Región de Murcia así como el lugar 1539 en el ranking de los investigadores más citados en España. Hay que tener en cuenta que las listas incluyen todas las áreas de conocimiento.

Igualmente, hay que tener en cuenta que el estudio está basado en las bases de datos de Google Académico, y los investigadores que no estén dados de alta en las mismas, nunca aparecerán en este tipo de estudios. Además, contabiliza cualquier tipo de citación, además de las incluidas en las revistas de impacto.

Por lo tanto, se trata de un resultado sesgado, pero da una idea de la situación de cada investigador.

ranking investigadores MurciaRanking Cientificos Españoles 1-5000


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VISITA DEL GRUPO DE BIOTECNOLOGÍA DE FRUTALES (CEBAS-CSIC) AL CEIP GINÉS DÍAZ SAN CRISTÓBAL DE ALHAMA

El pasado día 17 de junio de 2019, el investigador Dr. José A. Hernández, del Grupo de Biotecnología de Frutales del CEBAS-CSIC, visitó el CEIP Ginés Díaz San Cristóbal de Alhama donde organizó varias actividades de ciencia a los alumnos de 6º de primaria, donde fue recibido por los profesores Antonio Fernández Paredes y Mónica Caja. En primer lugar, les proyectó el video institucional del CEBAS y otro video sobre el cultivo in vitro de plantas. Igualmente, les dio una pequeña charla sobre el origen del CSIC y del CEBAS.exposicion CEBASexposicion CEBAS_2

A continuación, pasaron al taller de Fisiología y Bioquímica Vegetal.  Les mostró cultivos in vitro de diferentes especies vegetales: plantas de estevia, paulonia, melocotonero, rosa, raíces pilosas de zanahoria morada y callos embriogénicos de estevia resistentes a salinidad. El Dr. José Antonio les dejó un bote con plantas in vitro de rosa, subcultivadas en un medio para enraizamiento. Los alumnos irán comprobando el crecimiento de las raíces.

plantas in vitroplantas in vitro_2

Con la ayuda de algunos alumnos, se hicieron homogenados de plántulas de guisante usando morteros de porcelana. Después de centrifugar los extractos les mostró la técnica de Bradford para la cuantificación de proteínas.

La siguiente actividad estuvo relacionada con la extracción de clorofila. De nuevo, con la ayuda de tres alumnos, tomaron hojas de plántulas de guisante, troceadas en pequeños trozos, y las pusieron en contacto con etanol. Además, se les mostró diferentes tubos que contenían clorofilas de hojas de melocotonero y de albaricoquero, extraídas con acetona al 80%.

extraccion chlbanderillas

En la cuarta actividad del taller, el Dr. Hernández hizo una extracción de clorofilas en un mortero en presencia de etanol puro. Esta mezcla se puso en contacto con luz UV para mostrar la fluorescencia de las clorofilas. Al iluminar con la luz UV, el extracto de clorofilas emite luz roja.

Finalmente, y para demostrar a los alumnos que el ambiente y nuestras propias manos están llenas de microorganismos, tomamos 4 placas de medio MS y los alumnos tocaron el medio de cultivo con sus propios dedos. Estas placas se quedaron en el CEIP para que después de varios días comprueben los resultados.

placa con hongos y bacterias

A continuación, el Dr. Hernández respondió a todas las preguntas y dudas de los alumnos.


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Desarrollo de un sistema electrónico “low-cost” para la medida de la fluorescencia de clorofilas en plantas

El grupo de Biotecnología de Frutales está participado de nuevo en la sexta Edición del Proyecto IDIES. El Dr. José A. Hernández (CEBAS-CSIC) ha trabajado en cooperación con el Dr. Juan Suardiaz (Profesor Titular del Departamento de Tecnología Electrónica, UPCT) y los alumnos del IES Alcántara, Jorge Parra García y Jordi Germán Calle León. Su tutora en el IES Alcántara fue la profesora Teresa de Jesús García.

El objetivo final del  proyecto fue el desarrollo de un sistema electrónico de bajo coste basado en Arduino, que permita detectar la emisión de fluorescencia de clorofilas y compararlo con un equipo profesional (IMAGIM-PAM, M-series, Heinz Walz, Effeltrich, Germany).

fluorimetro

caja 1

Arriba: Equipo IMAGIM-PAM, M-series, Walz. Abajo: Prototipo Low-Cost

Hemos comparado el prototipo fabricado (coste aproximado 100 €) con el equipo profesional (30000 €) en plantas sometidas a estrés salino. De forma cualitativa y cuantitativa, su funcionamiento es parecido al equipo profesional cuando las hojas se iluminan con luz roja (660 nm) e infrarroja cercana (850 nm), en relación con los parámetros de quenching no fotoquímico [Y(NPQ), NPQ y qN].

plantas C y 150 mm NaCl

Plantas de guisante usadas en el experimento

La respuesta que produce el equipo “Low-Cost” consiste en la propia fluorescencia de las clorofilas de las hojas. El equipo tiene luces led azules y rojas, cuyas ondas rebotan en las hojas y son de nuevo recogidas por un fotorreceptor colocado justo encima de la fuente de luz. Los datos de este receptor pasan al ordenador en una escala de 0 a 1023 bits, que son los datos que obtenemos, los cuales pueden ser transformados en µmoles de fotones m-2 s-1.

fluorescencia NaCl 150 mM

A la izquierda, resultados obtenidos con el Fluorímetro profesional, donde podemos observar un aumento de los parámetros de quenching no fotoquímico. A la derecha, los resultados numéricos (en bits) obtenidos con el prototipo low-cost.

En conclusión, este trabajo muestra como la técnica de fluorescencia de clorofilas es muy útil para valorar tanto situaciones de estrés abiótico como biótico, pudiendo analizar el efecto de dichos estreses en el cloroplasto, incluso antes de que se observen señales de síntomas en las hojas.

Estos resultados se presentarán en el VI Congreso IDIES, que se celebrará el próximo día 25 de junio de 2019 en el Palacio de Congresos Victor Villegas.


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OFERTA DE PROYECTO DE TESIS DOCTORAL AYUDAS PARA LA FORMACIÓN DE PROFESORADO UNIVERSITARIO (FPU) 2018 EN EL CEBAS-CSIC

APELLIDOS Y NOMBRE DEL DIRECTOR

 

Hernández Cortés José Antonio
TÍTULO DE LA TESIS

 

Caracterización fisiológica y bioquímica de la latencia en melocotonero: Interacción entre el metabolismo de carbohidratos, perfil hormonal y señalización redox
ÁREA CIENTÍFICA

 

Ciencias Agrarias
CENTRO/INSTITUTO

 

CEBAS
COMUNIDAD AUTÓNOMA/PROVINCIA

 

Murcia
CORREO ELECTRÓNICO DEL DIRECTOR

 

jahernan@cebas.csic.es
WEBSITE GRUPO DE INVESTIGACIÓN O CENTRO/INSTITUTO

 

http://www.cebas.csic.es/dep_spain/mejora/biotecnologia/biotec_lineas.html

https://antioxidantsgroup.wordpress.com/