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Plant ROS Research


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El sistema antioxidante de apoplasto y simplasto en plantas de cebolla: respuesta a largo plazo al estrés salino

En un trabajo reciente realizado en nuestro laboratorio, en cooperación con la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA, Venezuela) y la Universidad Técnica de Manabí (Ecuador), se ha estudiado la respuesta de los sistemas antioxidantes apoplásticos de raíz y de hojas de dos genotipos de cebolla (“Texas 502”, como sensible a salinidad y “Granex 429”,  como resistente) cultivadas en condiciones de salinidad.

Estos resultados formaron parte de la Tesis Doctoral de Grisaly García en la UCLA (Venezuela).

            Los datos de pérdida de electrolitos indicaron que la integridad de la membrana estaba afectada por el efecto de las sales, especialmente en la variedad “Texas 502” (Figura 1). En hojas, el daño provocado por la salinidad en las membranas era similar en ambos casos (Figura 1A). En las raíces, solo en el genotipo sensible a la sal, la pérdida de electrolitos aumentó fuertemente por el efecto del tratamiento de estrés, mostrando un aumento de 3.7 veces, en comparación con los valores  control (Figura 1B)

Fig 1
Figura 1. Pérdida de electrolitos (en%) de los tejidos de  raíz y foliares de dos genotipos de cebolla sometidos a estrés salino durante 20 días. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según el test de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. TxC (control “Texas 502”); TxS (“Texas 502”, sal estresado); GrC (control “Granex 429”); GrS (‘Granex 429’, estresado por sal).

            Detectamos actividad superóxido dismutasa (SOD) y peroxidasa (POX) en las fracciones apoplásticas de raíz y hoja de plantas de cebolla. La salinidad aumentó la actividad de SOD en simplasto de raíz en “Texas 502” y en las hojas de “Granex 429”. En contraste, la salinidad reducía la actividad de SOD en las fracciones apoplásticas de hojas y raíces de “Texas 502”, pero la actividad se mantenía en el apoplasto de “Granex 429”, resistente a salinidad (Figuras 2 y 3). En ‘Granex 429’, el estrés salino aumentó la actividad de la POX apoplástica de la hoja (Figura 4) y la actividad catalasa simpática (CAT) de ambos órganos (Figura 6), pero se produjo una disminución de la POX apoplástica de la raíz de “Texas 502” (Figura 4).

Fig 2
Figura 2. Efecto de la salinidad en la actividad SOD en  apoplasto de hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más información, ver Figura 1.
Fig 3
Figura 3. Efecto de la salinidad en la actividad SOD de simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más información, ver Figura 1.
Fig 4
Figura 4. Efecto de la salinidad en la actividad POX en el apoplasto de hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1.
Fig 5
Figura 5. Efecto de la salinidad en la actividad POX en simplasto de  hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1.
Fig 6
Figura 6. Efecto de la salinidad en la actividad CAT en simplasto de  hoja (A) y raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes. Para más detalles, ver Figura 1

            El estrés salino aumentó la actividad monodehidroascorbato reductasa (MDHAR) en simplasto de raíz y la hoja y en la glutatión reductasa GR en simplasto de la raíz, principalmente en ‘Granex 429’ (Figura 7 y 9). Sólo en esta variedad, resistente a salinidad, la actividad deshidroascorbato reductasa (DHAR) aumentó en simplasto de hoja (Figura 8). Por el contrario, la actividad GR disminuyó en simplasto de hoja sólo en “Texas 502”, sensible a salinidad (Figura 9).

Fig 7
Figura 7. Efecto de la salinidad en la actividad MDHAR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.
Fig 8
Figura 8. Efecto de la salinidad en la actividad DHAR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.
Fig 9
Figura 7. Efecto de la salinidad en la actividad GR en el simplasto de hoja (A) y  raíz (B) en dos genotipos de cebolla que difieren en la sensibilidad a la salinidad. Diferentes letras indican una diferencia estadística significativa entre los tratamientos de acuerdo con la prueba de Duncan (P <0.05). Los datos representan la media ± SE de al menos cuatro muestras diferentes.

La salinidad aumentó los niveles de ascorbato reducido (ASC) en las hojas, y no se observó acumulación de deshidroascorbato (DHA) en las raíces en ambos casos. Estas respuestas aumentaron el estado redox del ascorbato, especialmente en las raíces (Tabla 1 y 2). En contraste, la salinidad disminuyó el glutatión reducido (GSH), pero se acumulaba el glutatión oxidado (GSSG) en las hojas, disminuyendo el estado redox del glutatión (Tabla 1 y 2). La salinidad aumentó ligeramente la concentración de GSH de raíz en el genotipo tolerante a la sal y no se modificó en el genotipo sensible. Sin embargo no se produjo acumulación de GSSG, lo que favoreció el aumento y / o mantenimiento del estado redox del glutatión (Tabla 1 y 2). Estos resultados sugieren que la menor sensibilidad a la sal en “Granex 429” podría estar relacionada con un mejor rendimiento de la maquinaria antioxidante en condiciones de salinidad.

Table 1
Tabla 1. Efecto de la salinidad en el contenido de ascorbato reducido (ASC) y oxidado (DHA) en raíces y hojas de dos genotipos de cebolla con diferente sensibilidad al estrés salino.
Table 2
Tabla 2. Efecto de la salinidad en el contenido de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en raíces y hojas de dos genotipos de cebollaon diferente sensibilidad al estrés salino.

            Además, la salinidad provocaba una mayor acumulación de radicales superóxido (O2.-) en las paredes celulares de la variedad sensible a salinidad, en relación a la variedad resistente (Figura 10B y 10D). Este resultado estaba correlacionado con el mayor nivel de actividad SOD en el apoplasto y en simplasto de hoja en la variedad resistente, con respecto a la variedad sensible (Figuras 2 y 3). La incubación de hojas  en presencia de MnCl2 10 mM evitó la tinción de O2.- (Fig. 10 E.), lo que indicaba la especificidad de la tinción de NBT. En este sentido, MnCl2 es un agente catalizador altamente eficaz de la dismutación  de radicales O2.-.

Fig 10
Figura 10. Efecto del estrés salino sobre la acumulación de radicales superóxido, detectado por tinción histoquímica con NBT, en hojas de las plantas de cebolla. (A) Control ‘Texas 502’; (B) Plantas ‘Texas 502’ tratadas con sal ; (C) Detalle de la imagen anterior (D) Control ‘Granex 429 ‘; (E) plantas ‘Granex 429 ‘  tratadas con sal; (F) Hojas de plantas ‘Texas 502’ tratadas con sal teñidas en presencia de MnCl2 10 mM.

            De hecho, debido a que el sistema radicular es el que primero percibe el estrés salino, las defensas antioxidantes apoplásticas de la raíz se mantenían o aumentaban en el genotipo resistente a la salinidad, en comparación con el genotipo sensible. Además, este efecto también se observó en las fracciones apoplásticas y simpláticas de las hojas, lo que sugiere un mejor control de la producción de O2.- y H2O2, así como una mayor capacidad de reciclaje de ASC y GSH en el genotipo tolerante a la sal. Estas respuestas podrían explicar la mejor respuesta a salinidad del genotipo de cebolla ‘Granex 429’.

Para más información: 

Grisaly García María; Clemente-Moreno M.José ; Díaz-Vivancos Pedro ;  García Marina; Hernández José A. (2020)The apoplastic and symplastic  antioxidant system in onion: Response to long-term salt stress. Antioxidants, Special Issue “Extracelullar Antioxidant Systems in Plants”. 9, 67. https://doi.org/10.3390/antiox9010067.


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Metabolismo antioxidante y fluorescencia de clorofila durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas micropropagadas de Stevia rebaudiana Bertoni

En un trabajo reciente, publicado por el grupo del Dr. José A. Hernández en cooperación con el Dr. Abel Piqueras, se ha comprobado que las enzimas antioxidantes, la fluorescencia de clorofila y los niveles de peroxidación lipídica (un parámetro de estrés oxidativo)  pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de plantas micropropagadas de stevia durante la aclimatación a condiciones ex vitro. Estos parámetros proporcionan información muy útil para monitorizar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada para la producción de edulcorantes y antioxidantes naturales para la dieta.

Plantas

Fases de la aclimatación de las plantas de stevia. A: Multiplicación; B: Enraizamiento: C: 2 dias aclimatación; D: 2 semanas aclimatación; E: 4 semanas aclimatación

Introducción

La aplicación de técnicas de cultivo in vitro es una poderosa herramienta de proliferación vegetativa para muchas especies vegetales [Van-Huylenbroeck et al 2000]. Sin embargo, este proceso puede limitarse debido a pérdidas significativas durante la aclimatación a condiciones ex vitro. La mejora de la actividad fotosintética es un paso crítico para alcanzar una alta tasa de supervivencia durante la aclimatación de las plántulas in vitro [Carvalho et al 2001]. En otras palabras, la activación adecuada de la fotosíntesis es el punto clave para cambiar la forma de adquirir carbono de fuentes heterotróficas o mixotróficas (condiciones in vitro) a fuentes autotróficas (condiciones ex vitro). Las plantas micropropagadas son muy susceptibles a las condiciones ambientales después de la transferencia a condiciones ex vitro. Por ejemplo, las plantas ex vitro normalmente están expuestas  a una mayor intensidad luminosa que las plantas cultivadas en condiciones in vitro. Además, la humedad relativa (HR) también es menor en condiciones ex vitro, por lo que las plantas son propensas a sufrir desecación durante la aclimatación. Ambos fenómenos, que contribuyen al daño por fotoinhibición y al estrés hídrico, pueden inducir la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, las plantas cuentan con un mecanismo eficiente de defensa antioxidante para defenderse de los efectos nocivos de ROS. Estas defensas incluyen las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (ASC-GSH) (ascorbato peroxidasa (APX), monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), deshidroascorbato reductasa (DHAR) y glutatión reductasa (GR)) y enzimas captadoras de ROS (superóxido dismutasas (SOD), peroxidasas (POX) y catalasa (CAT). El conocimiento sobre el comportamiento de la maquinaria antioxidante durante la aclimatación ex vitro es muy escaso, y solo unos pocos investigadores han estudiado los cambios en los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos durante este proceso [Van-Huylenbroeck et al 2000; Carvalho et al 2006; Dewir et al 2015; El-Mahrouk et al 2016].

La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es un arbusto perenne perteneciente a la familia Asteraceae. Las hojas de S. rebaudiana contienen una alta concentración de esteviol glucósidos, siendo las formas prevalentes el esteviósido y el rebaudiósido A, empleados como edulcorantes naturales como sustitutos de la sacarosa [Zeng et al 2006]. Sin embargo, las semillas de stevia tienen poca viabilidad y la planta requiere condiciones específicas de humedad, luz y nutrientes. La acumulación de esteviol glucósidos en S. rebaudiana es muy variable debido a la variabilidad genética. El contenido total de esteviol glucósidos es diferente no solo entre plantas del mismo cultivar, sino también entre plantas similares en la misma etapa de desarrollo [Ceunen et al 2007]. Además, se ha observado una alta capacidad antioxidante de los extractos de hojas de S. rebaudiana, relacionados con su función como captadores de ROS [Ceunen et al 2007; Ghanta et al 2007). Estas funciones positivas se han asociado principalmente con la presencia de compuestos fenólicos [Ceunen et al 2007]. Además, se han descritos efectos positivos del esteviósido relacionados con la diabetes tipo II, la hipertensión, el síndrome metabólico y la aterosclerosis [Ceunen et al 2007]. Por lo tanto, la producción de plantas clonales in vitro con un perfil de esteviósido similar puede ser de interés comercial.

En consecuencia, este trabajo se ha centrado en la aclimatación a las condiciones ex vitro de clones de stevia, originada a partir de la micropropagación de plantas previamente caracterizadas como altos acumuladores de esteviol glucósidos [Cantabella et al 2017]. Durante el proceso de aclimatación, se siguió la evolución de diferentes parámetros, incluido el metabolismo antioxidante, la peroxidación lipídica como parámetro de estrés oxidativo y la fluorescencia de clorofila, para determinar el estrés oxidativo que las plantas de stevia podrían estar sufriendo durante el proceso antes mencionado.

Resultados y Discusión

Durante las primeras horas del proceso de aclimatación, las plantas de stevia parecían experimentar estrés debido a la modificación de las condiciones de cultivo, como se observa por el aumento en los niveles de peroxidación lipídica, medidos como TBARS. En ese sentido, se detectó un pico después de 2 días, aumentando en un 86% con respecto a los valores en la plántula (Figura 1). Posteriormente, y a medida que avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro, los valores de peroxidación lipídica disminuyeron progresivamente hasta alcanzar los valores iniciales (Figura 1). Por lo tanto, se produjo un estrés oxidativo durante las primeras horas de aclimatación, indicando un posible daño a las membranas como consecuencia del cambio de condiciones de cultivo.

Fig 1

Fig 1. Datos de peroxidación de lípidos durante la aclimatación de plantas de stevia

Respecto al comportamiento de las enzimas antioxidantes,   observamos una actividad menor de la enzima monodehidroascorbato reductasa (MDHAR) que la enzima dehidroascorbato reductasa (DHAR) después de 2 días de aclimatación. Sin embargo, después de 7 días de aclimatación, las plantas de stevia activaron la ruta MDHAR para reciclar el ascorbato, que es mucho más eficiente, desde un punto de vista energético, que la ruta DHAR (Figura 2).

Fig 2

Figura 2. Evolución de las enzimas del ciclo ASC-GSH durante el procesod e aclimatación de plantas de stevia

En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, la relación DHAR / MDHAR era casi 2. Esto sugiere que, en esa etapa, la actividad de DHAR era la vía predominante en el reciclaje de ascorbato en plantas de stevia, utilizando GSH como donante de electrones. Posteriormente, DHAR disminuyó y MDHAR aumentó progresivamente, alcanzando una relación DHAR / MDHAR de 0.22 después de 28 días de aclimatación, donde la actividad de MDHAR fue casi 5 veces mayor que la actividad de DHAR. Por lo tanto, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia utilizaron la forma MDHAR, empleando NADH como poder reductor. Es necesario aclarar que la utilización de NADH para reciclar el ASC es más eficiente energéticamente que el uso de GSH. Por lo tanto, se pueden especular diferentes posibilidades para explicar la mayor actividad de DHAR en condiciones in vitro y después de 2 días de aclimatación. La primera es que, en condiciones in vitro, los medios de cultivo contenían sacarosa, por lo que las plantas tenían suficiente fuente de carbono para generar energía a través de la glucólisis y de la respiración, y por lo tanto pueden permitirse el uso de GSH para reciclar ASC (la “forma ineficiente”). La segunda posibilidad es que después de 2 días del proceso de aclimatación, las plantas sufrieron un estrés oxidativo, según los datos de peroxidación lipídica. Dado que la sobreexpresión de DHAR se ha asociado con la tolerancia al estrés ambiental [Eltayeb et al 2006], la mayor actividad de DHAR observada en esta etapa podría tener una función para hacer frente al estrés resultante de las condiciones de aclimatación. La tercera explicación está relacionada con el papel de DHAR en el crecimiento y desarrollo de las plantas [Potters et al 2012]. Probablemente, después de 2 días de aclimatación, el aumento de DHAR podría tener una función en los procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas. También observamos que la actividad de MDHAR aumentó después de 7 días de aclimatación. En esta etapa, la fotosíntesis parecía funcionar correctamente, como lo observan los valores de fluorescencia de clorofila y ETR. Por lo tanto, a partir de ese momento, las plantas produjeron sus propios azúcares y energía para apoyar el crecimiento de las plantas. Probablemente, por esta razón, las plantas cambiaron la forma de reciclar el ascorbato de una manera eficiente, a través de NADH.

La actividad GR se comportó de manera similar a la actividad MDHAR. En ese sentido, GR aumentó a medida que avanzó el proceso de aclimatación de las plantas, alcanzando sus valores máximos después de 21 y 28 días de aclimatación (incrementos de 4.2 y 3.2 veces, respectivamente) (Figura 2).

Las actividades superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) mostraron un pico de actividad después de 7 días de aclimatación (Figura 3), lo que sugiere una protección contra las ROS (especies reactivas de oxígeno) que se podrían estar generando como consecuencia del cambio de cultivo in vitro a ex vitro. La actividad peroxidasa (POX) aumentó aproximadamente 2 veces después de 2 días de aclimatación y permaneció alta hasta el día 14 (Figura 3), probablemente relacionada con el endurecimiento de la pared celular y los procesos de lignificación.

Fig 3

Figura 3. Evolución de las enzimas SOD, CAT y POX durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Después de 2 días de aclimatación, las plantas mostraron valores más altos de los parámetros de quenching no fotoquímico [Y (NPQ), Y (NO), NPQ y qN] y valores bajos de los parámetros de quenching fotoquímico [Y (II), qP] (Figura 4), así como de la velocidad de transporte de electrones (ETR) (Figura 5). Durante el proceso de aclimatación, se observó una disminución progresiva en los parámetros de quenching no fotoquímicos y un aumento constante en los parámetros de quenching fotoquímico. En ese sentido, Y (NPQ) disminuyó progresivamente, reduciendo sus valores en un 40% y 50% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). Paralelamente, Y (NO) disminuyó durante el ensayo de aclimatación, alcanzando una disminución cercana al 40% y 30% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). NPQ muestra aumentos y disminuciones durante el proceso de aclimatación. Al principio, después de 7 días de aclimatación, este parámetro aumentó en un 22%. Luego, el valor NPQ aumentó en un 63% después de 14 días de aclimatación en relación con el valor precedente (día 7). Una semana después (día 21), nuevamente el valor NPQ aumentó en un 29% en comparación con el valor observado en la segunda semana (14 días). Finalmente, después de 28 días de aclimatación, se observó una disminución del 30% en el parámetro NPQ en relación con el valor observado después de 21 días (Fig. 4). Sin embargo, aunque los valores de qN disminuyeron durante el proceso de aclimatación, los cambios producidos no fueron estadísticamente significativos (Figura 4). Tanto NPQ como Y (NPQ) están relacionados con la energía disipada como calor por un mecanismo regulado (es decir, el ciclo de xantofila) [Zhang et al 2012]. En contraste, Y (NO) refleja la fracción de energía disipada pasivamente como calor y fluorescencia, principalmente debido a los centros de reacción del PSII cerrados. Por lo tanto, los valores altos de Y (NO) están relacionados con la incapacidad de las plantas para protegerse del exceso de luz. En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia mostraron los valores más altos de Y (NO), que disminuyeron progresivamente durante el proceso de aclimatación, lo que refleja una mejor regulación [Klughammer et al 2008]. Por otro lado, valores altos de los parámetros de quenching no fotoquímicos indicaban que las plantas estaban sufriendo un estrés. Sin embargo, a medida que la planta se adaptaba a las nuevas condiciones ex vitro, estos parámetros disminuyeron.

Fig 4

FIgura 4. Evolución de los parámetros de fluorescencia de clorofilas durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Con respecto a los parámetros de quenching fotoquímico (Y (II) y qP), se produjo un aumento progresivo durante la aclimatación. En ambos casos, los valores aumentaron cerca de 3 veces después de 7 y 14 días de aclimatación, y aproximadamente 5 veces después de 21 y 28 días del proceso (Figura 4). Fv / Fm mostró los valores más bajos después de 2 días de aclimatación. Este parámetro aumentó después de 7 y 14 días, y luego disminuyó ligeramente después de 21 y 28 días de aclimatación, pero sus valores permanecieron estadísticamente más altos que los valores iniciales (Tabla 1). Los cambios observados en Y (II) y qP se correlacionaron con la evolución de los valores de ETR, alcanzando un aumento de casi 6 veces al final (28 días) del proceso de aclimatación (Figura 5). Esta respuesta de los parámetros de fluorescencia de clorofilas indicaba una mayor eficiencia fotosintética conforme avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro.

Fig 5

Figura 5. Evolución de la tasa de transporte electrónico durante el proces de aclimatación de plantas de stevia

Conclusiones

En conjunto, los datos sugirieron que las enzimas antioxidantes, la peroxidación lipídica y los parámetros de fluorescencia de clorofila pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de las plantas micropropagadas durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas de stevia, proporcionando información muy útil para controlar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación. Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada de edulcorantes y antioxidantes naturales para una dieta sana.

Para más información:

José Ramón Acosta-Motos, Laura Noguera Vera, Gregorio Barba-Espín, Abel Piqueras, José A. Hernández (2019) Antioxidant metabolism and chlorophyll fluorescence during the acclimatisation to ex vitro conditions of micropropagated Stevia rebaudiana Bertoni plants. Antioxidants, Special Issue “Antioxidants and Foods”, 8, 615.  (https://www.mdpi.com/2076-3921/8/12/615)

 

Bibliografía

Cantabella, D.; Piqueras, A.; Acosta-Motos, J.R.; Bernal-Vicente, A.; Hernandez, J.A.; Diaz-Vivancos, P. Salt-tolerance mechanisms induced in Stevia rebaudiana Bertoni: effects on mineral nutrition, antioxidative metabolism and steviol glycoside content. Plant Physiol. Biochem. 2017, 115, 484–496.

Carvalho, L.C.; Osorio, M.L.; Chaves, M.M.; Amâncio S. Chlorophyll fluorescence as an indicator of photosynthetic functioning of in vitro grapevine and chestnut plantlets under ex vitro acclimatization. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2001, 67, 271–280.

Carvalho, L.C.; Vilela, B.J.; Vidigal, P.; Mullineaux, P.M.; Amâncio, S. Activation of the ascorbate-glutathione cycle is an early response of micropropagated Vitis vinifera L. explants transferred to ex vitro. Int. J. Plant Sci. 2006, 167, 759-770.

Ceunen, S.; Geuns, J.M.C. Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1201−1228.

Dewir, Y.H.; El-Mahrouk, M.E.; Al-Shmgani, H.S.; Rihan, H.Z.; Teixeira da Silva, J.A.; Fuller, M.P. Photosynthetic and biochemical characterization of in vitro-derived African violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl) plants to ex vitro conditions. J. Plant Interact. 2015, 10, 101-108.

El-Mahrouk, M.E.; Dewir, Y.H.; Murthy, H.N.; Rihan, H.Z.; Al-Shmgani, H.S.; Fuller, M.P. Effect of photosynthetic photon flux density on growth, photosynthetic competence and antioxidant enzymes activity during ex vitro acclimatization of Dieffenbachia cultivars. Plant Growth Regul. 2016, 79, 29–37.

Eltayeb, A.E.; Kawano, N.; Badawi, G.H.; Kaminaka, H.; Sanekata, T.; Morishima, I.; Shibahara, T.; Inanaga, S.; Tanaka, K. Enhanced tolerance to ozone and drought stresses in transgenic tobacco overexpressing dehydroascorbate reductase in cytosol. Physiol. Plant. 2006, 127, 57–65.

Ghanta, S.; Banerjee, A.; Poddar, A.; Chattopadhyay, S. Oxidative DNA Damage Preventive Activity and Antioxidant Potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a Natural Sweetener. J. Agr.Food Chem. 2007, 55, 10962-10967.

Klughammer, C.; Schreiber, U. Complementary PSII quantum yields calculated from simple fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the saturation pulse method. PAM Application Notes (PAN) 2008, 1, 27-35

Potters, G.; Horemans, N.; Caubergs, R.J.; Asard, H. Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension. Plant Physiol. 2012, 124, 17-20.

Van-Huylenbroeck, J.M.; Piqueras, A.; Debergh, P.C. The evolution of photosynthetic capacity and the antioxidant enzymatic system during acclimatization of micropropagated Calathea plants. Plant Sci. 2000, 155, 59-66.

Zeng, J.; Cheng, A.; Lim, D.; Yi, B.; Wu, W. Effects of salt stress on the growth, physiological responses, and glycoside contents of Stevia rebaudiana Bertoni. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5720-5726.

Zhang, Q.Y.; Wang, L.Y.; Kong, F.Y.; Deng, Y.S.; Li, B.; Meng, Q.W. Constitutive accumulation of zeaxanthin in tomato alleviates salt stress-induced photoinhibition and photooxidation. Physiol. Plant. 2012, 146, 363–373.

 


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Mandelonitrile-associated salicylic acid biosynthesis in peach under abiotic and biotic stresses

Diaz-Vivancos P; Bernal-Vicente A; Petri C; Cantabella D; Hernández JA

(Poster presented at the SMPR2019 congress (Valencia, 10-11 December 2019)

Abstract

Even though that salicylic acid (SA) is a key regulator of plant stress responses and other biological processes, its biosynthetic pathways have not been fully characterized. The proposed SA synthesis originates from chorismate by two distinct pathways: isochorismate and phenylalanine (Phe) ammonia-lyase (PAL) pathways. Cyanogenesis is the process related to the release of hydrogen cyanide from endogenous cyanogenic glycosides (CNglcs), and it has been linked to plant plasticity improvement. The main CNglcs in peach are prunasin and amygdalin, with mandelonitrile (MD), synthesized from Phe, controlling their turnover.

Using [13C]-labelled compounds and metabolomic analysis, we showed that MD, and hence CNglcs turnover, is involved, at least in part, in SA biosynthesis in peach plants. MD-treated peach plants displayed increased SA levels via benzoic acid (one of the SA precursors within the PAL pathway). Moreover, MD treatment modulated the H2O2 levels and had a pleiotropic effect on abscisic acid (ABA) and jasmonic acid (JA) levels (data not shown). Under the stress conditions, however, the contribution of this SA biosynthetic pathway from MD to the total SA pool does not seem to be important. Nevertheless, MD treatment not only increased SA levels, but also improved peach plants performance under the stressful conditions. In fact, MD provided partial protection against Plum pox virus (PPV) infection and stimulated the accumulation of phytotoxic ions in roots in PPV- and NaCl-stressed peach seedlings respectively.

Thus, we proposed a third pathway, alternative to the PAL pathway, for SA synthesis in peach plants, linking SA biosynthesis and cyanogenesis (Fig. 1). This proposed pathway seems to be functional under stress conditions, although the fact that CNglcs may be operating more broadly than by influencing SA pathways and signaling con not be ruled out.

Material and Methods

Plant material

The assays were performed on GF305 peach (Prunus persica L.) plants, under both greenhouse and in vitro conditions. For ex vitro assays, after submitting the GF305 peach seedlings to an artificial rest period in a cold chamber to ensure uniformity and fast growth, seedlings were grown in 2-L pots in an insect-proof greenhouse and distributed into three batches (control and MD- and Phe-treated) of 15 plants each. Plants were irrigated twice per week with water (control) and 1 mM MD or 1 mM Phe for 7 weeks. None of the treatments affected plant growth and development. For in vitro assays [13C]-labeled compounds were used, and 200 mM MD- or Phe-alpha[13C] (Campro Scientific GmbH, Germany) was added to the micropropagation medium during two subcultures. This concentration was selected after carrying out a preliminary assay using concentrations of both compounds ranging from 50 to 1000 mM; 200 mM was the highest concentration that did not show any deleterious effect on the development of micropropagated peach shoots.

Metabolomic analysis

The levels of Phe, MD, amygdalin, BA and SA were determined in in vitro micropropagated shoots at the Metabolomics Platform at CEBAS-CSIC (Murcia, Spain).

SA levels in peach seedlings

The SA levels in leaves of GF305 seedlings treated with MD or Phe were determined using a UHPLC-mass spectrometer (Q-Exactive, ThermoFisher Scientific) at the Plant Hormone Quantification Platform at IBMCP (Valencia, Spain).

Extraction and enzymatic assays

The activities of ascorbate peroxidase (APX),  peroxidase (POX), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in in vitro shoots and ex vitro leaf samples were assayed as described in Diaz-Vivancos et al. (2017) and Bernal-Vicente et al. (2018; 2019).

Results

FIG 1

Fig. 1. Proposed salicylic acid (SA) biosynthetic pathway in peach plants. Blue arrows indicate the SA biosynthesis in plants described previously. The dotted arrow indicates a putative pathway. Red arrows show the new pathway suggested for peach plants. CYP79 and CYP71, Cyt P450 monooxygenases; MDL1, mandelonitrile lyase.

FIG 2

Fig. 2. Percentage (of total amount detected) of [13C]- phenylalanine (Phe), mandelonitrile (MD) and salicylic acid (SA) in non-stressed, NaCl-stressed and Plum pox virus (PPV)-infected peach shoots micropropagated in the presence or absence of [13C]MD or [13C]Phe. Ions with an additional 1.0035 accurate mass and confirmation by isotopic distribution and spacing were defined as ions marked with 13C. Data represent the mean of at least 20 repetitions of each treatment.

FIG 3

Fig. 3 Total levels (mMg–1 FW) of amygdalin, benzoic acid, mandelonitrile, phenylalanine and salicylic acid, and mandelonitrile lyase (MDL) enzymatic activity in micropropagated peach shoots in the presence or absence of [13C]MD or [13C]Phe. Data represent the mean ± SE of at least 12 repetitions of each treatment. In each graph different letters above the columns indicate significant differences according to Duncan’s test (P< 0.05).

FIG 4

Fig. 4. Total SA level (ng g–1 DW) in the leaves of peach seedlings grown in the presence or absence of MD or Phe submitted to 34 mM NaCl (A) or PPV infection (B). Data represent the mean ± SE of at least five repetitions of each treatment. Different letters indicate significant differences according to Duncan’s test (P≤0.05).

Fig-5

Fig. 5. Summary of the differential response of MD treatment in salt-stressed and PPV-infected peach seedlings. Data from Diaz-Vivancos et al. (2017) and Bernal-Vicente et al. (2018; 2019).

TABLE 1

Table 1.- Effect of MD and Phe on H2O2-scavenging activities (APX, POX, CAT)  and SOD (H2O2-producing) activity in GF305 micropropagated shoots and seedlings. APX is expressed as nmol min-1 mg-1 protein. POX and CAT are expressed as µmol min-1 mg-1 protein. SOD as U mg-1 protein. Data represent the mean ± SE of at least four repetitions. It has been previously described that SA led to H2O2 accumulation (Durner & Klessig 1995; Rao et al. 1997).

Conclusions

We provide strong  evidences showing that CNglcs turnover is involved, at least in part, in SA biosynthesis in peach plants under control and stress conditions.

MD seems to act as a hub controlling the CNglcs turnover and the SA and amygdalin biosynthesis. MD-treated peach plants displayed increased SA levels via benzoic acid (one of the SA precursors within the PAL pathway).

We have also found evidence that this new SA biosynthetic pathway also works also under stress conditions. MD treatment improved the plant performance of peach plants under salinity or PPV-infection conditions. However, the contribution of this pathway to the SA pool does not seem to be relevant under these stress conditions.

MD also modulated the content in other stress related hormones as well as the antioxidant defenses, that could activate different redox-related signaling pathways.

Our data agrees with the previously reported role for CNglcs in oxidative stress tolerance (Gleadow & Møller 2014; Gleadow et al. 2016).

References

  • Diaz-Vivancos et al (2017) Plant & Cell Physiology 58(12): 2057–2066
  • Durner J and Klessig DF (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 92(24): 11312-11316
  • Bernal-Vicente et al (2018) Plant Biology 20(6):986-994
  • Bernal-Vicente et al (2019) Plant Biology DOI: 10.1111/plb.13066
  • Gleadow Møller (2014) Annual Review of Plant Biology 65:155–185
  • Gleadow et al (2016) Journal of Experimental Botany 6:403-5413
  • Rao et al (1997) Plant Physiology 115:137–149.

 

This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects AGL2014-52563-R; RTA2017-00011-C03-02).


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Desarrollo de un sistema electrónico “low-cost” para la medida de la fluorescencia de clorofilas en plantas

El grupo de Biotecnología de Frutales está participado de nuevo en la sexta Edición del Proyecto IDIES. El Dr. José A. Hernández (CEBAS-CSIC) ha trabajado en cooperación con el Dr. Juan Suardiaz (Profesor Titular del Departamento de Tecnología Electrónica, UPCT) y los alumnos del IES Alcántara, Jorge Parra García y Jordi Germán Calle León. Su tutora en el IES Alcántara fue la profesora Teresa de Jesús García.

El objetivo final del  proyecto fue el desarrollo de un sistema electrónico de bajo coste basado en Arduino, que permita detectar la emisión de fluorescencia de clorofilas y compararlo con un equipo profesional (IMAGIM-PAM, M-series, Heinz Walz, Effeltrich, Germany).

fluorimetro

caja 1

Arriba: Equipo IMAGIM-PAM, M-series, Walz. Abajo: Prototipo Low-Cost

Hemos comparado el prototipo fabricado (coste aproximado 100 €) con el equipo profesional (30000 €) en plantas sometidas a estrés salino. De forma cualitativa y cuantitativa, su funcionamiento es parecido al equipo profesional cuando las hojas se iluminan con luz roja (660 nm) e infrarroja cercana (850 nm), en relación con los parámetros de quenching no fotoquímico [Y(NPQ), NPQ y qN].

plantas C y 150 mm NaCl

Plantas de guisante usadas en el experimento

La respuesta que produce el equipo “Low-Cost” consiste en la propia fluorescencia de las clorofilas de las hojas. El equipo tiene luces led azules y rojas, cuyas ondas rebotan en las hojas y son de nuevo recogidas por un fotorreceptor colocado justo encima de la fuente de luz. Los datos de este receptor pasan al ordenador en una escala de 0 a 1023 bits, que son los datos que obtenemos, los cuales pueden ser transformados en µmoles de fotones m-2 s-1.

fluorescencia NaCl 150 mM

A la izquierda, resultados obtenidos con el Fluorímetro profesional, donde podemos observar un aumento de los parámetros de quenching no fotoquímico. A la derecha, los resultados numéricos (en bits) obtenidos con el prototipo low-cost.

En conclusión, este trabajo muestra como la técnica de fluorescencia de clorofilas es muy útil para valorar tanto situaciones de estrés abiótico como biótico, pudiendo analizar el efecto de dichos estreses en el cloroplasto, incluso antes de que se observen señales de síntomas en las hojas.

Estos resultados se presentarán en el VI Congreso IDIES, que se celebrará el próximo día 25 de junio de 2019 en el Palacio de Congresos Victor Villegas.


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ACLIMATACIÓN DE PLANTAS DE STEVIA A CONDICIONES EX-VITRO Y ESTUDIO DE SU RESPUESTA A SALINIDAD

 

El Grupo de Biotecnología de Frutales ha conseguido micropropagar y aclimatar plantas de Stevia rebaudiana y estudiar su respuesta  a salinidad en macetas.

La Stevia es un edulcorante natural no calórico que posee una capacidad endulzante unas 300 veces superior a la sacarosa. La producción a gran escala de Stevia se ve limitada en primer lugar por la baja germinación de sus semillas. En este sentido, en nuestro grupo, hemos desarrollado un protocolo para multiplicar las plantas de Stevia en condiciones in vitro con el fin de obtener plantas clonales.

Enraizamiento de plantas in vitro y aclimatación a condiciones ex-vitro

Estas plantas, adaptadas a condiciones ex vitro (en macetas) se sometieron a estrés salino y comprobamos que desarrollaban mecanismos de adaptación para crecer con salinidades de 2 y 5 g/L.  Entre dichos mecanismos observamos adaptaciones fisiológicas relacionadas con el desarrollo, acumulación de iones y fluorescencia de clorofilas. Por otro lado, también tenían lugar una serie de adaptaciones a nivel bioquímico como cambios en enzimas antioxidantes, contenido de clorofilas y prolina (aminoácido implicado en la tolerancia a estrés salino). Estos cambios les permiten sobrevivir en dichas condiciones de estrés ya que les permiten un ajuste osmótico, una protección de la fotosíntesis y una defensa frente al estrés oxidativo provocado por la salinidad.

Control                         2 g/l                           5 g/l

Efecto de la salinidad en el crecimiento de plantas de stevia y en la fluorescencia de clorofila (de arriba a abajo, qN, qP y NPQ).

En lo que a la producción de esteviósidos, hemos descrito un aumento con la edad de la planta de los contenidos del esteviósido que tiene mejores características comerciales, el Rebaudiósido A, lo que puede tener un interés comercial. Además, observamos que la salinidad no afectaba de una forma significativa la concentración del Rebaudiósido A.

Este trabajo demuestra que es posible usar aguas salinas u otras fuentes alternativas, como aguas de depuradora, para crecer estas plantas así como para la producción de este tipo de edulcorantes naturales.

Stevia La Verdad

Equipo Investigador

 

Para más información

Daniel Cantabella, Abel Piqueras, José Ramón Acosta.Motos, Agustina Bernal-Vicente, José A. Hernández, Pedro Díaz-Vivancos (2017) Salt-tolerance mechanisms induced in Stevia rebaudiana Bertoni: Effects on mineral nutrition, antioxidative metabolism and steviol glycoside content. Plant Physiol Biochem 115: 484-496. d.o.i.:10.1016/j.plaphy.2017.04.023.


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FUNCION DEL ASCORBATO EN LA PROTECCIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS: (II) Los carotenoides y el ciclo de las Xantofilas

José A. Hernández Cortés y Pedro Díaz Vivancos (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC)

Los carotenoides, además de servir como pigmentos accesorios, cumplen una función esencial en la fotoprotección de la maquinaria fotosintética. Los mecanismos de fotoprotección actúan como válvulas de seguridad, eliminando o liberando el exceso de energía antes de que pueda dañar a la planta.

Cuando la energía almacenada en las moléculas de clorofila en estado excitado se disipa rápidamente (mediante transferencia de excitación o fotoquímica) se dice que ese estado excitado está capturado (en inglés “quenched”) (Fig. 1). En castellano, el vocablo quenched significa apagado, aplacado, sofocado, calmado, extinguido, mitigado….. Si el estado de excitación de las clorofilas no es extinguido mediante transferencia fotoquímica (a través de la cadena de electrones) puede reaccionar con el oxígeno molecular (O2 ) y formar un estado excitado de esta molécula denominado oxígeno singlete (1O2) (Fig. 1). Esta forma activada del O2 puede reaccionar con cualquier componente celular, especialmente con los lípidos de las membranas celulares (Taiz y Zeiger 2010).

Los carotenoides ejercen su acción fotoprotectora mediante la captura del estado excitado de las clorofilas. El estado excitado de los carotenoides no tiene suficiente energía como para transferirla al O2 (por lo tanto no se forma 1O2), de modo que este estado excitado de los carotenoides decae hasta su estado fundamental perdiendo la energía en forma de calor (Fig. 1).

Fig 1 para ciclo X

Fig. 1.-  A: Condiciones donde toda la energía absorbida por la clorofila (Chl) es usada para la fotosíntesis. B: Condiciones de estrés lumínico donde sólo una parte de la energía absorbida por la Chl es usada para hacer fotosíntesis. En este último caso, para te la energía de excitación puede ser transferida al O2 para formar oxígeno singlete (1O2). El exceso de energía puede ser disipado de una forma segura en procesos fotoprotectivos en presencia de Zeatina a pH ácido en el interior de las membranas de los tilacoides con el fin de prevenir la formación de 1O2 . En este caso, la energía de la Chl excitada se puede usar para procesos fotoquímicos o bien se puede perder de forma segura en forma de calor. Modificado a partir de Demming-Adams y Adams (1996).

 

 

Se denomina quenching no fotoquímico (NPQ) a la captura de la fluorescencia de las clorofilas por procesos diferentes a los fotoquímicos. Gracias a los procesos de NPQ, una fracción importante de la energía de excitación de los sistemas antena causado por un estrés lumínico es capturado (quenched) y convertido en calor (Baker 2008). En este sentido, el NPQ está implicado en los mecanismos de protección de la maquinaria fotosintética cuando se produce una sobreexcitación, protegiendo de los posibles daños derivados. Los mecanismos moleculares del NPQ no están del todo dilucidados y se sugiere que hay varios procesos de quenching. El pH del lumen tilacoidal y el estado de agregación de los complejos antena son factores importantes. Además, se sabe que tres carotenoides, denominados xantofilas, están implicados en este mecanismo de NPQ: La violaxantina (V), la anteroxantina (A) y la zeaxantina (Z) (Taiz y Zeiger 2010).

En condiciones de alta iluminación (o debido a otro tipo de estrés que cause una limitación en la fijación de CO2 como la sequía o salinidad), la V es convertida a Z, pasando por el intermedio A, por acción de la enzima Violaxantina de-epoxidasa (VDE) en una reacción dependiente de ascorbato (ASC). A este conjunto de reacciones se le conoce como Ciclo de las Xantofilas (Fig. 2), implicado en la disipación del exceso de energía luminosa en forma de calor en las hojas.

Cuando el estrés desaparece o se reduce, el proceso se revierte (paso de Z a A). En este proceso se consume NADPH, generando NADP+, el aceptor final de electrones de la cadena de transporte. Por lo tanto, volvemos a encontrarnos con el ASC mediando una función protectora de la maquinaria fotosintética.

La unión de los protones y de la Z a las proteínas de las antenas colectoras de luz en los tilacoides, causan cambios conformacionales que conducen a la captura de energía y a la disipación en forma de calor (Demming-Adam y Adams 1992).

 

La deficiencia de ASC limita el ciclo de las Xantofilas

Como hemos comentado anteriormente, en respuesta a una alta intensidad luminosa (y a otros estreses, que pueden ir combinados), las plantas ponen en marcha mecanismos que les permiten disipar el exceso de luz absorbida en forma de calor. Uno de estos mecanismos es el NPQ, que requiere de la conversión de V a Z, por acción de la enzima VDE. Esta enzima se localiza en el lumen de los tilacoides, se activa a pH ácido (aprox 6.5, con una actividad máxima a pH 5) y necesita ASC como poder reductor (donador de electrones). Para comprobar la importancia fisiológica del ASC para el proceso de NPQ se han realizado experimentos empleando mutantes de Arabidopsis que contienen bajos niveles de ASC, como el mutante vtc, que contiene un 25% de los niveles de ASC que contienen las plantas silvestres. Cuando las plantas se crecen en presencia de una alta intensidad luminosa (1500 µmoles fotones m-2 s-1) los mutantes presentaron valores más bajos de NPQ, pero valores similares de ETR (tasa de transporte electrónico). Este menor NPQ era paralelo a una menor tasa de conversión de A a Z medido en tilacoides aislados. Cuando se aplicaba ASC a las hojas o a preparaciones de tilacoides se rescataba el fenotipo mutante, ya que se conseguía un aumento en NPQ y en los niveles de Z estableciéndose una unión clara entre ASC, Z y NPQ (Müller-Moulé et al., 2002).

 

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés)  en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés) en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

 

La susceptibilidad a estrés oxidativo mostrado por los mutantes deficientes en ASC se puede explicar no sólo por su reducida capacidad antioxidante sino también por presentar un ciclo de las xantofilas menos activo, reflejado por reducidos niveles de NPQ.

La relación ASC-NPQ también se ha demostrado empleando mutantes que sobreproducen ASC (mutante miox4), que presentan altos valores de NPQ (Tòth et al., 2011). Por otro lado, se ha demostrado también una función importante de la enzima deshidroascorbato reductasa (DHAR, enzima que recicla el ASC) en el proceso de NPQ, ya que la supresión de la expresión de esta enzima daba lugar a bajos valores de NPQ y a un aumento de los contenidos de especies reactivas del oxígeno (ROS) con tratamientos de estrés lumínico (Chen y Gallie 2008).

Conclusiones

El ciclo de las Xantofilas constituye un mecanismo de defensa para proteger a la fotosíntesis (y por tanto al cloroplasto) que permite la eliminación del exceso de energía en forma de calor de forma segura. La acción de este ciclo previene la formación de 1O2 evitando daños oxidativos. Como podemos comprobar, de nuevo el ASC es una pieza importante en el mecanismo de acción de este ciclo, ya que en su ausencia se produce un descenso en los procesos de quenching no fotoquímico (NPQ).

Referencias

  • Baker NR (2008) Annu. Rev. Plant Biol. 59: 89-113.
  • Chen y Gallie (2008) J. Biol. Chem. 283: 21347-21361.
  • Demming-Adam and Adams (1992) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 43: 599-626.
  • Demming-Adam and Adams (1996) Trend in Plant Sci 1: 21-26
  • Müller-Moulé et al (2002) Plant Physiol 128: 970-977
  • Taiz y Zieger (2010) Plant Physiology, Fifth edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. ISBN 978-0-87893-866-7.
  • Tôth et al (2013) Physiol Plant 148: 161-175.


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Polyamines and response to salt stress in grapevine plantlets

  • José A. Hernández Cortés, Group of Fruit Biotechnology, CEBAS-CSIC (Murcia, Spain)

A recent work, carried out in our laboratory, studied the role of polyamines in the salt stress adaptation in grapevine (Vitis vinifera L.) plantlets.

Salinity is one of the most important stress factors which limits the growth and development of plants by altering their morphological, physiological and biochemical attributes. Salinity induced a water deficit as well as an ionic toxicity in the plants resulting in an alteration in the ionic homeostasis. In addition to the osmotic and toxic effects, salt stress is also manifested as an oxidative stress, contributing all these factors to the deleterious effects of salinity in plants (Hernández et al., 2001; 2003). To mitigate and repair damage initiated by ROS, plants have developed a complex antioxidant defense system. The primary components of this system include carotenoids, ascorbate, glutathione, tocopherols and enzymes such as superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (EC 1.11.1.6), glutathione peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9), peroxidases and the enzymes involved in the ascorbate-glutathione cycle (ASC-GSH cycle; Foyer and Halliwell 1976): ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.1), dehydroascorbate reductase (DHAR, EC 1.8.5.1), monodehydroascorbate reductase (MDHAR, EC 1.6.5.4) and glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2) (Noctor and Foyer 1998).

Plant polyamines (PAs) have been suggested to play important roles in morphogenesis, growth, embryogenesis, organ development, leaf senescence, and abiotic and biotic stress responses (Kusano et al., 2008). Therefore, homeostasis of cellular PA levels is also a defensive strategy that plants have developed to cope with adverse situations (Chinnusamy et al., 2005; Groppa and Benavides, 2008). Putrescine (Put), spermidine (Spd), and spermine (Spm) are the major PA pools commonly present in higher plants and known as active oxygen scavenging compounds being considered as mediators in protective reactions against different stresses (Kovacs et al., 2010). However, PAs can also increase ROS production through its catabolism in the apoplast by the action of Cu-containing amino oxidase (CuAO) and polyamine oxidase (PAO) activities (Smith, 1985).

We studied the effect of salt stress in the presence and the absence of MGBG, an inhibitor of S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) activity, involved in PA biosynthesis, in order to investigate the effects of both treatments on photosynthesis and oxidative metabolism providing new information about the contribution of PA metabolism to salt stress adaptation in grapevine plantlets.

 

Results

Salt stress applied in the culture medium of in vitro grapevine plantlets disturbed the growth rate. The application of MGBG, an inhibitor of SAMDC, resulted in further deterioration of plant growth, especially under salt stress conditions. Leaves from salt treated plantlets developed chlorotic symptoms in the leaf margins; this effect was more evident in the presence of both treatments (Fig. 1).Figure-1

Salt stress produced an alteration in the fluorescence chlorophyll parameters in grapevine leaves. In this sense, a decrease in the photochemical quenching parameters [qP and Y(II)] and an increase in the non-photochemical parameters (qN and NPQ) was observed (Fig 2). The presence of the inhibitor MGBG had no important effect on qN, but it decreased NPQ values, as well as qP and Y(II) (Fig. 2).The effect of NaCl and MGBG on Fv/Fm was less pronounced when the measure was performed in the middle of the leaves. However, when Fv/Fm was recorded near the chlorotic areas (in the leaves margins) the effect of NaCl and/or MGBG was more noticeable (Fig. 2).

Figure-2

NaCl and MGBG treatments induced an oxidative stress as shown by the increase in lipid peroxidation level, measured as TBARS. A synergistic effect on lipid peroxidation was observed in salt-treated plantlets grown in the presence of MGBG (Fig. 3). The increase in lipid peroxidation, and therefore the damage to membrane was parallel with ROS accumulation (H2O2 and O2.-) detected by histochemical staining with DAB, or NBT, respectively (Figs. 4 and 5).

Fig-4Fig-5

 

Salt treatment affected the PA contents in grapevine plantlets, especially the free and conjugate forms of agmatine (Agm) and Put. MGBG induced also a small rise in Agm content, whereas Put, Spd and Spm levels remained relatively unchanged in non-salinized plantlets (Fig. 6). The effect of salt-stress on Agm and Put was intensified in the presence of MGBG, mainly in their free forms. Surprisingly, the level of Spd remained unaffected by MGBG whatever its form, while, a 27% decrease in bound Spm was observed in the same conditions (Fig. 6).

Fig-6

Salt-stress induced a decrease in APX activity whereas no significant effect in MDHAR was recorded (Fig. 7). However, significant increases in SOD and POX activities were induced by NaCl (Fig. 7). The incubation of grapevine plantlets in the presence of MGBG produced no effects in APX activity, whereas significant increases in MDHAR, SOD and POX were observed, and a similar situation was recorded in the presence of both treatments (NaCl plus MGBG) (Fig. 7).

Figure-7

Salt-stress slightly affected the reduced ASC contents, although a strong accumulation in oxidized ascorbate (DHA) was recorded. This effect resulted in a strong decrease in the redox state of ascorbate in NaCl-treated plants (Table 1). No effect in the reduced ASC contents was observed when grapevine plantlets were incubated with MGBG. However, a significant decrease was noticed after simultaneous incubation with NaCl and MGBG (Table 1). Surprisingly, in plants treated with MGBG, in absence or presence of NaCl, no accumulation of DHA was noticed. Even a decrease in DHA in relation to control plants occurred, and accordingly, an increase in the redox state of ascorbate (Table 1). Salt-stress also produced a decrease in reduced glutathione (GSH) both in the absence and in the presence of MGBG (Table 1). In contrast, the treatment with MGBG alone had no effect in GSH contents. No significant change in oxidised glutathione (GSSG) was produced, but due to the negative effect of NaCl in GSH, a decrease in the redox state of glutathione was observed in salt-stressed grapevine plantlets (Table 1).

 

Table 1

Results showed that MGBG treatment contribute to the deleterious effect of oxidative stress in grapevine plantlets grown in presence of NaCl, affecting different physiological and biochemical processes, including plant growth, PA levels,  photosynthesis and redox state of the cells, highlighting a possible protecting role of PA homeostasis in plants subjected to salt stress.

These results suggest that maintaining polyamine biosynthesis through the enhanced SAMDC activity in grapevine leaf tissues under salt stress conditions could contribute to the enhanced ROS scavenging activity and a protection of photosynthetic apparatus from oxidative damages.

 

 

References

  • Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK. (2005) Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Sci 45:437–448.
  • Foyer CH, Halliwell B (1976) Presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta 133: 21-25.
  • Groppa MD, Benavides MP. (2008) Polyamines and abiotic stress: recent advances. Amino Acids 2008; 34:35–45.
  • Hernández JA, Ferrer MA, Jiménez A, Ros-Barceló A, Sevilla F. (2001) Antioxidant systems and O2.-/H2O2 production in the apoplast of Pisum sativum L. leaves: its relation with NaCl-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Physiol 127:817-831.
  • Hernández JA, Aguilar A, Portillo B, López-Gómez E, Mataix Beneyto J, García-Legaz MF. (2003) The effect of calcium on the antioxidant enzymes from salt-treated loquat and anger plants. Funct Plant Biol 30:1127-1137.
  • Kovacs Z, Simon-Sarkadi L, Szücs A, Kocsy G. (2010) Different effects of cold, osmotic stress and abscisic acid on polyamine accumulation in wheat. Amino Acids 38: 623–631.
  • Kusano T, Yamaguchi K, Barberich T, Takahashi Y. (2007) The polyamine spermine rescues Arabidopsis from salinity and drought stresses. Plant Signal Behav 2:250-251.
  • Noctor G, Foyer CH. (1998) Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 249-279.
  • Smith TA.  (1985) The di- and poly-amine oxidases of higher plants. Biochem Soc Trans 13:319-322.

 

For more information, please consult:

Ikbal FE, Hernández JA, Barba-Espín G, Koussa T, Aziz A, Faize M, Diaz-Vivancos P. (2014) Enhanced salt-induced antioxidative responses involve a contribution of polyamine biosynthesis in grapevine plants. J Plant Physiol. 2014, 171:779-88. doi: 10.1016/j.jplph.2014.02.006.

 

 

 


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Fluorescencia de clorofilas

José A. Hernández, Grupo de Biotecnología de Frutales (CEBAS-CSIC)

La fluorescencia es un fenómeno foto-físico de las moléculas de clorofila que permite estudiar la función del fotosistema II (PSII) durante el transporte electrónico en la fotosíntesis y la sensibilidad del PSII al daño que puede sufrir por efecto de diferentes estreses, y las consecuencias que esto tiene en el proceso global de la fotosíntesis (Figura 1).

Por tanto, la fluorescencia de clorofilas es una técnica muy útil que permite hacer un seguimiento al proceso de fotosíntesis en general. Se emplea en diferentes estudios:

  •  Fisiología de la fotosíntesis
  • Ecofisiología
  • Biología Marina y Acuática
  • Horticultura
  • Agricultura
  • Fisiología de Post-cosecha
  • Mejora Vegetal
  • Genética

¿Qué es la fluorescencia?

Los electrones que forman parte de un átomo o una molécula tienden a permanecer en un estado de menor energía (estado fundamental). Si un átomo absorbe un fotón con suficiente energía, un electrón puede saltar a un orbital de mayor energía. Este estado de mayor energía es más reactivo que el estado fundamental y puede participar en reacciones químicas que son imposibles para el estado fundamental. Esto es muy importante para la fotosíntesis. Incluso en ausencia de reacciones, el estado excitado es inestable y puede volver a sus estado fundamental por diferentes vías, incluido la emisión de un fotón. El fotón emitido es la fluorescencia.

Figura 1. Esquema en Z de la cadena de transporte de electrones en el cloroplasto.

Figura 1. Esquema en Z de la cadena de transporte de electrones en el cloroplasto.

La energía luminosa absorbida por las moléculas de clorofila en la hoja tiene tres posibles destinos: La mayor parte se va a usar en fotosíntesis (energía fotoquímica). Una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia) con el fin de que el exceso de energía no dañe a los fotosistemas. La cantidad de energía emitida como fluorescencia es muy pequeña (1-2% del total de luz absorbida) (Figura 2).

Figura 2. Esquema mostrando el uso de la energía luminosa en condiciones fisiológicas. La mayor parte se va a usar en fotosíntesis y una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia).

Figura 2. Esquema mostrando el uso de la energía luminosa en condiciones fisiológicas. La mayor parte se va a usar en fotosíntesis y una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia).

En condiciones normales, la fotosíntesis predomina sobre los otros procesos, pero en condiciones de estrés, la planta no puede trabajar a pleno rendimiento y el exceso de energía debe disiparse. Como consecuencia, los procesos no fotoquímicos aumentan.

Para un análisis de fluorescencia es conveniente adaptar a la planta a condiciones de oscuridad durante unos 10-15 minutos. Cuando una hoja se transfiere desde la oscuridad a la luz, los centros de reacción del PSII se van cerrando progresivamente. Esto da lugar a un aumento en el rendimiento de la fluorescencia de las clorofilas. A partir de este momento, los niveles de fluorescencia disminuyen de nuevo. Este fenómeno se conoce como quenching y se explica  de dos maneras: Primero, se produce un incremento en la tasa de transporte de electrones fuera del PSII. Esto es debido a la activación mediada por luz de los enzimas implicados en el metabolismo del carbono y en la apertura de los estomas. Este tipo de quenching se denomina “quenching fotoquímico”. Al mismo tiempo, se produce un aumento de la eficiencia en la que la energía se convierte en calor. Este último proceso se denomina “quenching no fotoquímico” (NPQ).

Para el análisis de la fluorescencia de clorofilas se han definido y calculado diferentes coeficientes para cuantificar el quenching fotoquímico y no fotoquímico. Para los procesos fotoquímicos, el parámetro más útil para medir la eficiencia del PSII es el rendimiento cuántico del PSII (ØPSII o Y(II)), que mide la proporción de luz absorbida por la clorofila asociada al PSII  que es usada en procesos fotoquímicos. Otro parámetro ampliamente usado es el quenching fotoquímico (qP).  Aunque es muy similar al ØPSII , el significado del qP es algo diferente. En este caso, el qP hace referencia a la proporción de centros de reacción del PSII que están abiertos. ØPSII y qP están interrelacionados con un tercer parámetro, Fv/Fm, que mide la eficiencia del PSII, es decir, mide el rendimiento cuántico si todos los centros de reacción del PSII estuviesen abiertos.

Los procesos no fotoquímicos (NPQ) están relacionados con la disipación de calor, y su escala varía desde 0 hasta el infinito. El NPQ tiene varios componentes, pero el más importante es el denominado qN (coeficiente del quenching no fotoquímico). Este parámetro varía en una escala desde 0 a 1 y está relacionado con la disipación de calor mediante el ciclo de las xantofilas (Fig 3). NPQ y qN son indicadores de estrés y han demostrado ser parámetros muy sensibles para la detección temprana de condiciones de estrés mediante imagen de fluorescencia. En este sentido se pueden usar para valorar situaciones de estrés abiótico como biótico, pudiendo analizar el efecto de estreses ambientales en el cloroplasto, incluso antes de que se observen señales de síntomas en las hojas (Fig 4).

Figura 3. Esquema del ciclo de las Xantofilas. La interconversión de anteroxantina en zeaxantina lleva asociada una disipación de energía en forma de calor.

Figura 3. Esquema del ciclo de las Xantofilas. La interconversión de anteroxantina en zeaxantina lleva asociada una disipación de energía en forma de calor.

Figura 4. Efecto del estrés hídrico sobre los parámetros qP y qN. Las plantas 1,2 y 3 se sometieron a un periodo de falta de riego de 15 días. Las imágenes muestran cómo el estrés reduce el valor de qP, pero de forma más dramática en plantas 1 y 2. Por el contrario, la sequía aumenta la disipación de calor (qN) en las plantas 1 y 2 con el fin de poder minimizar daños por exceso de energía luminosa. La planta 3 presenta sólo una pequeña variación en qN.

Figura 4. Efecto del estrés hídrico sobre los parámetros qP y qN. Las plantas 1,2 y 3 se sometieron a un periodo de falta de riego de 15 días. Las imágenes muestran cómo el estrés reduce el valor de qP, pero de forma más dramática en plantas 1 y 2. Por el contrario, la sequía aumenta la disipación de calor (qN) en las plantas 1 y 2 con el fin de poder minimizar daños por exceso de energía luminosa. La planta 3 presenta sólo una pequeña variación en qN.

Para más información:

  • Maxwell K, Johnson GN (2000) Chlorophyll fluorescence – a practical guide. J. Exp. Bot. 51: 659-668.
  • Pérez-Bueno ML, Ciscato M, vandeVen M, Gacía-Luque I, Valcke R, Barón M (2006) Imaging viral infection: studies on Nicotiana benthamiana plants infected with the pepper mild mottle tobamovirus. Photosyntesis Research 90:111–123.
  • Taiz L, Zeiger E (2010) Plant  Physiology, Fifth Edition, Sinauer Associates Inc., Publishers, Sinderland, Massachusetts, USA


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IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS ANTIOXIDANTES DEL CITOPLASMA EN LA RESPUESTA A ESTRÉS ABIÓTICO

José A. Hernández, Investigador Científico del CSIC. Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS, Murcia.

Todas las situaciones de estrés que afecten al balance hídrico de las plantas van a inducir un cierre de estomas para limitar la pérdida de agua por transpiración. Esto es lo que ocurre cuando una planta se somete a estreses como la salinidad o la sequía. El cierre de estomas rápidamente va a provocar una reducción en la asimilación del CO2 por parte del cloroplasto. Esto ralentiza las reacciones del ciclo de Calvin,  lo que conlleva a un menor consumo de NADPH y ATP. Esta respuesta se traduce en una falta de regeneración de aceptores electrónicos (NADP+, ADP), facilitando la cesión de electrones de la cadena de transporte electrónico al oxígeno , dando lugara una mayor generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en el cloroplasto, como radicales superóxido y de H2O2 .  Por lo tanto, el cloroplasto va a ser el primer compartimento celular que sufra los efectos de estreses abióticos como la salinidad o la sequía. Estos ROS pueden provocar daños oxidativos en este orgánulo, pero también se puede producir una salida del H2O2 del cloroplasto, lo que podría provocar un estrés oxidativo en el citoplasma.

En trabajos realizados en nuestro grupo, pusimos de manifiesto la importancia de los mecanismos antioxidantes del citoplasma en la protección de los cloroplastos en plantas sometidas a estrés salino o hídrico.

En una variedad de guisante relativamente tolerante a 70 mM NaCl, comprobamos que dicha tolerancia estaba correlacionada con un aumento de las enzimas del ciclo ASC-GSH en el citosol así como la inducción de los transcritos (ARNm) codificantes para APX, GR y CuZn-SOD citosólicas. Sin embargo, esta respuesta no tenía lugar en una variedad de guisante susceptible a salinidad (Hernández et al 2000) (ver Figura 1).

La importancia de los mecanismos de defensa antioxidantes del citosol en la protección de los cloroplastos también se ha descrito en condiciones de estrés hídrico en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresaban CuZn-SOD (cytsod) y APX (cytapx) en el citoplasma. Este trabajo muestra que la sobreexpresión simultánea de cytsod y cytapx, o al menos la de cytapx, en el citosol aliviaba el daño producido por estrés hídrico moderado (hasta 5 días sin regar). Esta sobreexpresión de enzimas citosólicas también aumentaba los niveles de otras enzimas de defensa, como DHAR, MDHAR, POX, Catalasa y SOD en fracción soluble (Figura 1) y de APX, POX y SOD en cloroplastos. Además, las líneas transgénicas acumulaban menos H2O2 y presentaban un menor nivel de daños en membrana, medido como pérdida de electrolitos y como peroxidación de lípidos en hojas (Faize et al., 2011).

 

Figura 1: Esquema simplificando el efecto del cierre estomático, inducido por salinidad y sequía, sobre la generación de ROS en la cadena de transporte electrónico del cloroplasto y la respuesta de los mecanismos antioxidantes citosólicos en hojas de guisante y tabaco en respuesta a salinidad y sequía, respectivamente.

Figura 1: Esquema simplificando el efecto del cierre estomático, inducido por salinidad y sequía, sobre la generación de ROS en la cadena de transporte electrónico del cloroplasto y la respuesta de los mecanismos antioxidantes citosólicos en hojas de guisante y tabaco en respuesta a salinidad y sequía, respectivamente.

 

 

Para más información:

HERNANDEZ JA, JIMENEZ A, MULLINEAUX PM AND SEVILLA F (2000) Tolerance of pea (Pisum sativum L.) to long-term salt stress is associated with induction of antioxidant defences. Plant Cell Environm 23:853-862.

FAIZE M, BURGOS L, FAIZE L, PIQUERAS A, NICOLAS E, BARBA-ESPIN G, CLEMENTE-MORENO MJ, ALCOBENDAS R, ARTLIP T,  HERNANDEZ JA (2011) Involvement of cytosolic ascorbate peroxidase and Cu,Zn-superoxide dismutase for improved tolerance against drought stress. J. Exp. Bot. 62:2599-2613.

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