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Plant ROS Research


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FUNCION DEL ASCORBATO EN LA PROTECCIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS: (II) Los carotenoides y el ciclo de las Xantofilas

José A. Hernández Cortés y Pedro Díaz Vivancos (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC)

Los carotenoides, además de servir como pigmentos accesorios, cumplen una función esencial en la fotoprotección de la maquinaria fotosintética. Los mecanismos de fotoprotección actúan como válvulas de seguridad, eliminando o liberando el exceso de energía antes de que pueda dañar a la planta.

Cuando la energía almacenada en las moléculas de clorofila en estado excitado se disipa rápidamente (mediante transferencia de excitación o fotoquímica) se dice que ese estado excitado está capturado (en inglés “quenched”) (Fig. 1). En castellano, el vocablo quenched significa apagado, aplacado, sofocado, calmado, extinguido, mitigado….. Si el estado de excitación de las clorofilas no es extinguido mediante transferencia fotoquímica (a través de la cadena de electrones) puede reaccionar con el oxígeno molecular (O2 ) y formar un estado excitado de esta molécula denominado oxígeno singlete (1O2) (Fig. 1). Esta forma activada del O2 puede reaccionar con cualquier componente celular, especialmente con los lípidos de las membranas celulares (Taiz y Zeiger 2010).

Los carotenoides ejercen su acción fotoprotectora mediante la captura del estado excitado de las clorofilas. El estado excitado de los carotenoides no tiene suficiente energía como para transferirla al O2 (por lo tanto no se forma 1O2), de modo que este estado excitado de los carotenoides decae hasta su estado fundamental perdiendo la energía en forma de calor (Fig. 1).

Fig 1 para ciclo X

Fig. 1.-  A: Condiciones donde toda la energía absorbida por la clorofila (Chl) es usada para la fotosíntesis. B: Condiciones de estrés lumínico donde sólo una parte de la energía absorbida por la Chl es usada para hacer fotosíntesis. En este último caso, para te la energía de excitación puede ser transferida al O2 para formar oxígeno singlete (1O2). El exceso de energía puede ser disipado de una forma segura en procesos fotoprotectivos en presencia de Zeatina a pH ácido en el interior de las membranas de los tilacoides con el fin de prevenir la formación de 1O2 . En este caso, la energía de la Chl excitada se puede usar para procesos fotoquímicos o bien se puede perder de forma segura en forma de calor. Modificado a partir de Demming-Adams y Adams (1996).

 

 

Se denomina quenching no fotoquímico (NPQ) a la captura de la fluorescencia de las clorofilas por procesos diferentes a los fotoquímicos. Gracias a los procesos de NPQ, una fracción importante de la energía de excitación de los sistemas antena causado por un estrés lumínico es capturado (quenched) y convertido en calor (Baker 2008). En este sentido, el NPQ está implicado en los mecanismos de protección de la maquinaria fotosintética cuando se produce una sobreexcitación, protegiendo de los posibles daños derivados. Los mecanismos moleculares del NPQ no están del todo dilucidados y se sugiere que hay varios procesos de quenching. El pH del lumen tilacoidal y el estado de agregación de los complejos antena son factores importantes. Además, se sabe que tres carotenoides, denominados xantofilas, están implicados en este mecanismo de NPQ: La violaxantina (V), la anteroxantina (A) y la zeaxantina (Z) (Taiz y Zeiger 2010).

En condiciones de alta iluminación (o debido a otro tipo de estrés que cause una limitación en la fijación de CO2 como la sequía o salinidad), la V es convertida a Z, pasando por el intermedio A, por acción de la enzima Violaxantina de-epoxidasa (VDE) en una reacción dependiente de ascorbato (ASC). A este conjunto de reacciones se le conoce como Ciclo de las Xantofilas (Fig. 2), implicado en la disipación del exceso de energía luminosa en forma de calor en las hojas.

Cuando el estrés desaparece o se reduce, el proceso se revierte (paso de Z a A). En este proceso se consume NADPH, generando NADP+, el aceptor final de electrones de la cadena de transporte. Por lo tanto, volvemos a encontrarnos con el ASC mediando una función protectora de la maquinaria fotosintética.

La unión de los protones y de la Z a las proteínas de las antenas colectoras de luz en los tilacoides, causan cambios conformacionales que conducen a la captura de energía y a la disipación en forma de calor (Demming-Adam y Adams 1992).

 

La deficiencia de ASC limita el ciclo de las Xantofilas

Como hemos comentado anteriormente, en respuesta a una alta intensidad luminosa (y a otros estreses, que pueden ir combinados), las plantas ponen en marcha mecanismos que les permiten disipar el exceso de luz absorbida en forma de calor. Uno de estos mecanismos es el NPQ, que requiere de la conversión de V a Z, por acción de la enzima VDE. Esta enzima se localiza en el lumen de los tilacoides, se activa a pH ácido (aprox 6.5, con una actividad máxima a pH 5) y necesita ASC como poder reductor (donador de electrones). Para comprobar la importancia fisiológica del ASC para el proceso de NPQ se han realizado experimentos empleando mutantes de Arabidopsis que contienen bajos niveles de ASC, como el mutante vtc, que contiene un 25% de los niveles de ASC que contienen las plantas silvestres. Cuando las plantas se crecen en presencia de una alta intensidad luminosa (1500 µmoles fotones m-2 s-1) los mutantes presentaron valores más bajos de NPQ, pero valores similares de ETR (tasa de transporte electrónico). Este menor NPQ era paralelo a una menor tasa de conversión de A a Z medido en tilacoides aislados. Cuando se aplicaba ASC a las hojas o a preparaciones de tilacoides se rescataba el fenotipo mutante, ya que se conseguía un aumento en NPQ y en los niveles de Z estableciéndose una unión clara entre ASC, Z y NPQ (Müller-Moulé et al., 2002).

 

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés)  en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés) en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

 

La susceptibilidad a estrés oxidativo mostrado por los mutantes deficientes en ASC se puede explicar no sólo por su reducida capacidad antioxidante sino también por presentar un ciclo de las xantofilas menos activo, reflejado por reducidos niveles de NPQ.

La relación ASC-NPQ también se ha demostrado empleando mutantes que sobreproducen ASC (mutante miox4), que presentan altos valores de NPQ (Tòth et al., 2011). Por otro lado, se ha demostrado también una función importante de la enzima deshidroascorbato reductasa (DHAR, enzima que recicla el ASC) en el proceso de NPQ, ya que la supresión de la expresión de esta enzima daba lugar a bajos valores de NPQ y a un aumento de los contenidos de especies reactivas del oxígeno (ROS) con tratamientos de estrés lumínico (Chen y Gallie 2008).

Conclusiones

El ciclo de las Xantofilas constituye un mecanismo de defensa para proteger a la fotosíntesis (y por tanto al cloroplasto) que permite la eliminación del exceso de energía en forma de calor de forma segura. La acción de este ciclo previene la formación de 1O2 evitando daños oxidativos. Como podemos comprobar, de nuevo el ASC es una pieza importante en el mecanismo de acción de este ciclo, ya que en su ausencia se produce un descenso en los procesos de quenching no fotoquímico (NPQ).

Referencias

  • Baker NR (2008) Annu. Rev. Plant Biol. 59: 89-113.
  • Chen y Gallie (2008) J. Biol. Chem. 283: 21347-21361.
  • Demming-Adam and Adams (1992) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 43: 599-626.
  • Demming-Adam and Adams (1996) Trend in Plant Sci 1: 21-26
  • Müller-Moulé et al (2002) Plant Physiol 128: 970-977
  • Taiz y Zieger (2010) Plant Physiology, Fifth edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. ISBN 978-0-87893-866-7.
  • Tôth et al (2013) Physiol Plant 148: 161-175.


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FUNCION DEL ASCORBATO EN LA PROTECCIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS: (I) La reacción de Mehler y el ciclo agua-agua

José A. Hernández Cortés y Pedro Díaz-Vivancos (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC)

El ascorbato (ASC, también llamado Vitamina C) es una molécula multifuncional en las plantas. La mayoría de las funciones biológicas del ASC derivan de su capacidad para actuar como un agente reductor (es decir, que cede electrones a otras moléculas). Esta capacidad hace del ASC una molécula antioxidante muy eficaz.

Además de su papel como antioxidante, el ASC puede participar en otras funciones, como en el desarrollo celular, en la síntesis de la pared celular, modula la síntesis de algunas fitohormonas (ácido abcísico, giberelinas, etileno, ácido salicílico), participa en el control del movimiento de los estomas (https://cienciacebas.wordpress.com/2013/12/12/regulacion-del-cierre-estomatico-una-funcion-representada-por-varios-actores/), interviene en la acumulación de antocianos durante la aclimatación a alta intensidad luminosa, etc…

Sin embargo, en esta entrada vamos a centrarnos en la función(es) del ASC en el cloroplasto como un protector de la maquinaria fotosintética.

Función antioxidante del ASC en el estroma del cloroplasto

El ASC, junto con el glutatión (https://cienciacebas.wordpress.com/2013/04/03/glutation-una-molecula-para-todo/), participa en la eliminación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en el denominado ciclo agua-agua (Asada 1999). Este ciclo comienza con la denominada reacción de Mehler. La reducción del oxígeno molecular (O2) hasta superóxido y H2O2 por los electrones de la cadena de transporte electrónico fotosintético en el PSI se denomina “Reacción de Mehler” (Mehler 1951) (Fig. 1).

Fig. 1. Reacción de Mheler. PS, fotosistema; SOD, superóxido dismutasa.

Fig. 1. Reacción de Mehler. PS, fotosistema; SOD, superóxido dismutasa.

Años más tarde, el profesor Kozy Asada describió el denominado ciclo agua-agua, esto es la fotorreducción del O2 hasta agua en el PSI empleando los electrones procedentes de la fotólisis del agua en el PSII (Asada, 1999, 2006). Este ciclo incluye la reacción de Mehler, es decir, comienza con la fotólisis de la molécula de agua en el PSII, la fotorreducción del O2 para producir radicales superóxido (O2.- ) en el PSI y la dismutación del O2.- hasta H2O2 por acción de la isoenzima Cu,Zn-SOD unida a tilacoides.

El ciclo agua-agua continúa con la reducción del H2O2 hasta agua por la acción de la enzima ascorbato peroxidasa (APX). Esta reacción puede ocurrir tanto en el tilacoide como en el estroma, ya que parte del H2O2 producido puede difundir al estroma del cloroplasto. En esta reacción, la APX usa el ASC como donador de electrones para reducir el H2O2 hasta agua generando radicales monodeshidroascorbate (MDHA).APX

A continuación, el MDHA generado tiene que ser reducido para regenerar el ASC. Esta reacción puede ocurrir de dos formas:

Bien puede ocurrir de forma espontánea vía ferredoxina reducida (Fdred) en el PSI,

Mono espontanea

o bien mediante la reacción de la enzima monodeshidroascorbato reductasa (MDHAR) en el estroma del cloroplasto:

MDHAR

Además, el MDHA puede desproporcionar directamente para producir ASC y deshidroascorbato (DHA), que puede difundir al estroma, donde es reducido hasta ASC por acción de la enzima deshidroascorbato reductasa (DHAR), en una reacción dependiente de GSH (glutatión reducido) generando glutatión oxidado (GSSG). A continuación el GSH es regenerado a partir de GSSG por acción de la enzima glutatión reductasa (GR) que emplea NADPH como poder reductor:

DHAR y GR

Como podemos ver en estas reacciones, el ciclo agua-agua proporciona aceptores electrónicos para el PSI, es decir, Fdox y NADP+.

Fig. 2 Esquema del Ciclo Agua-agua (desarrollado a partir del ciclo agua-agua descrito por Asada (1999).

Fig. 2 Esquema del Ciclo Agua-agua (desarrollado a partir del ciclo agua-agua descrito por Asada (1999).

En el esquema del ciclo agua-agua (flechas azul marino) podemos observar que la mitad de los electrones derivados de la fotólisis del agua en el PSII son utilizados para la reducción del O2 hasta O2.-, mientras que la otra mitad se emplean para regenerar las moléculas reductoras (el ASC) que se emplean para reducir el H2O2 hasta agua.

Funciones de la Reacción de Mehler y del ciclo agua-agua

La generación de ROS en el cloroplasto está influida por factores fisiológicos y ambientales, de modo que esta tasa aumenta cuando el flujo de intensidad luminosa está en exceso del requerido para la fijación de CO2 (Asada 1999, 2006). La fotoproducción y eliminación de ROS no sólo protege al cloroplasto de los efectos dañinos de dichos ROS sino que también actúa como una válvula de escape para el exceso de fotones. En este sentido el ciclo agua-agua cumple una serie de funciones de protección:

 

1.- Ajuste de la relación ATP/NADPH

El ciclo agua-agua (incluyendo la reacción de Mehler) proporciona un flujo lineal de electrones favoreciendo la generación de un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide, lo que permite la síntesis de ATP que no es consumido en el ciclo agua-agua (a esta producción de ATP se le denomina fotofosforilación pseudocíclica). Por lo tanto, permite un aumento del ratio ATP/NADPH en el cloroplasto. Una alta relación ATP/NADPH favorece la ruta fotorrespiratoria, por lo que podemos decir que el ciclo agua-agua aporta ATP adicional para la fotorrespiración.

2.-Protección frente a las ROS

Si el ciclo no fuese activo, tanto O2.- como H2O2 difundirían al estroma y oxidarían moléculas diana en el cloroplasto. En presencia de metales de transición (Fe, Cu), liberados de las proteínas, se podría catalizar la generación de radicales hidroxilo (.OH). La acumulación de H2O2 podría inhibir la APX en ausencia de ASC. La fijación de CO2 se inhibe hasta un 50% en presencia de 10 µM de H2O2 (Kaiser 1976). Además, el H2O2 es un inhibidor de las enzimas CuZn-SOD, Fructosa 1,6-bifosfatasa; Ribulosa 5 fosfato Kinasa, gliceraldehído-3-P- deshidrogenasa, sedoheptulosa 1,7-bisfosfatasa.

El radical O2.- inhibe enzimas que contiene grupos 4Fe-4S (como aconitasa o 6-fosfogluconato dehidratasa), mientras que los radicales .OH inhiben las enzimas glutamato sintasa y Rubisco.

3.- Disipación del exceso de fotones en condiciones de estrés

El ciclo agua-agua induce y mantiene la denominada “down-regulation” del PS II (una bajada de la actividad del PSII) mediante la generación de un gradiente de protones. Este gradiente de protones es importante para la formación de zeatina en el lumen de los tilacoides (este mecanismo lo veremos en una siguiente entrada “ciclo de las xantofilas” en el que el ASC tiene también una función importante).

Además, el ciclo puede disipar el exceso de fotones utilizando el O2 como aceptor de electrones generando H2O sin producirse la liberación de O2.- ni de H2O2 incluso si los aceptores electrónicos fisiológicos no están disponibles.

 

CONCLUSIONES

  • El ASC tiene un papel fundamental en la eliminación del H2O2 generado en la reacción de Mehler.
  • El ciclo Agua-Agua regenera aceptores electrónicos cono la Fdox y NADP+. Este último es el aceptor final preferido en la cadena de transporte.
  • El ciclo Agua-Agua genera ATP que puede ser utilizado en el Ciclo de Calvin-Benson o en la ruta fotorrespiratoria.
  • El ciclo Agua-Agua actúa como una válvula de escape permitiendo disipar el exceso de fotones en condiciones de estrés ambiental.

 

Referencias

Asada K. (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 50:601-639.

Asada K. (2006) Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions. Plant Physiol. 141: 391-396.

Kaiser (1976) Biochem Biophys Acta 440: 476-482.

Mehler AH (1951) Studies on reactions of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Arch Biochem Biophys. 33:65-77.


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La Vitamina C o Ácido Ascórbico: Un antioxidante diseñado para proteger a las células aerobias

José A. Hernández y Pedro Díaz Vivancos, Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC, Murcia

En 1912, ya postulada la hipótesis de la vitamina (del latín vita: vida y amina: compuesto de nitrógeno) (Funk, 1912), se estableció que el escorbuto era una enfermedad causada por la falta en la dieta de un compuesto desconocido soluble en agua. Veinte años más tarde, en 1932, el equipo de investigación Húngaro de Svirbely y Szent-Györgyi, descubrieron una nueva molécula de azúcar de 6 carbonos con función desconocida que denominaron ácido hexurónico. Poco después y debido a su actividad contra el escorbuto, el ácido hexurónico de identificó como vitamina C o ácido ascórbico (Svirbely y Szent-Györgyi, 1932), demostrando que el ácido ascórbico (ASC) y la vitamina C eran la misma molécula. En 1959 el bioquímico americano JJ Burns demostró que la susceptibilidad al escorbuto, en aquellos mamíferos que lo sufrían, era debido a su incapacidad para producir la enzima L-Gulono-1,4-lactona oxidasa, implicada en la síntesis del ASC en el hígado a partir de la glucosa (Fig 1).Fig 1 glu ASC

Biosíntesis del Ácido Ascórbico (ASC)

Todas las especies vegetales y todos los tipos celulares de plantas estudiados hasta la fecha son capaces de sintetizar ASC. El conocimiento de la biosíntesis del ASC es de gran interés por dos motivos fundamentales:

Es un componente clave del sistema antioxidante de las plantas, y éstas son la principal fuente de vitamina C en la dieta humana (Smirnoff et al., 2001).

Los reptiles y las órdenes más antiguas de aves sintetizan el ácido ascórbico en los riñones. Las órdenes recientes de aves y la mayor parte de mamíferos sintetizan el ácido ascórbico en el hígado, donde la enzima L-Gulono-1,4-lactona oxidasa (GulLO) cataliza la última reacción de la síntesis de ácido ascórbico a partir de la glucosa. Los humanos, algunos otros primates, los conejillos de indias, ciertas especies de aves y los peces teleósteos no son capaces de sintetizar la GulLO debido a una mutación en el gen que la codifica, y son por tanto incapaces de fabricar ácido ascórbico en el hígado. La mutación no es letal para el organismo, debido a que la vitamina C es abundante en los alimentos frescos.

En plantas superiores, la biosíntesis del ASC tiene lugar mediante la ruta D-manosa/L-galactosa o ruta de Smirnoff-Wheeler (Wheeler et al., 1998) (Fig. 2). En esta ruta la D-manosa es transformada a L-galactosa, la cual es oxidada hasta L-galactono-1,4-lactona que es convertida en ASC por la acción de la enzima L- galactono-1,4-lactona deshidrogenasa (L-GalLDH), localizada en la membrana interna de la mitocondria. Esta reacción usa citocromo c de la cadena de transporte electrónico como aceptor final (Bartoli et al., 2000). Sin embargo, se han descrito otras rutas alternativas para la síntesis del ASC: la ruta de la L-gulosa, la ruta del mio-inositol y la ruta del ácido D-galacturónico (Fig. 2).

Figura 2.-  Rutas de biosíntesis del ASC en plantas: (1) Ruta de  Smirnoff-Wheeler pathway, (2) Ruta de la L-gulosa, (3) Ruta del Mioinositol (4) Ruta del ácido D-galacturónico. (Reproducido de Venkatesh y Park 2014).

Figura 2.- Rutas de biosíntesis del ASC en plantas: (1) Ruta de Smirnoff-Wheeler pathway, (2) Ruta de la L-gulosa, (3) Ruta del Mioinositol (4) Ruta del ácido D-galacturónico. (Reproducido de Venkatesh y Park 2014).

 

Funciones del ASC en las plantas

El ASC está considerado como una molécula multi-función. Es el principal antioxidante presente en las células vegetales cumpliendo una función vital en la eliminación de especies reactivas del oxígeno (ROS) mediante una detoxificación tanto enzimática como no enzimática. Además, actúa como una molécula señalizadora en numerosos procesos, incluyendo la división y expansión celular, el metabolismo de la pared celular, la formación de meristemos apicales, el crecimiento de la raíz, la fotosíntesis, la regulación de la floración o de la senescencia vegetal, y en respuestas de defensa frente a situaciones de estrés ambiental. Todas estas funciones pueden estar relacionadas por su función como cofactor de numerosos procesos enzimáticos en plantas.

En este sentido, numerosas enzimas requieren ASC como cofactor para su actividad catalítica (de Tullio et al., 2003; Gest et al., 2013):

1- La Ascorbato Peroxidasa (APX) es probablemente la enzima más conocida debido a su capacidad para usar ASC específicamente en la eliminación del agua oxigenada (H2O2). Además en ASC puede reaccionar con ROS como el H2O2, el radical superóxido (O2.-) y el radical hidroxilo (.OH).

 

2- Es cofactor de muchas dioxigenasas dependientes de oxiácidos, que catalizan la incorporación del O2 a sustratos orgánicos. Este tipo de dioxigenasas comparten un mecanismo catalítico común que requiere de forma específica ASC, Fe2+ y 2-oxoglutarato (Prescot y John, 1996). Entre estas enzimas se incluyen:

  • Peptidil-prolil-4-hidroxilasa (P4H) implicada en la síntesis de colágeno en animales y de la hidroxilación de la prolina en plantas para ña síntesis de glicoproteíans ricas en hidroxiprolina.
  • Flavona sintasa y flavonona 3β-hidroxilasas, implicadas en la síntesis de flavonoides.
  • GA 13-hidroxilasa, GA 20-0xidasa, GA 3β-hidroxilasa, GA 2β-hidroxilasa y GA 3-oxidasa, implicadas en el metabolismo de las giberelinas (GAs)
  • 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasas (conocidas como NECDs) implicada en el paso clave de la biosíntesis del ácido abcísico (ABA).
  • 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACCO), la enzima que cataliza el último paso de la biosíntesis del etileno.
  • Violaxantina de-epoxidasa, en el ciclo de las xantofilas (Fig 3). Este ciclo permite la disipación de energía luminosa como calor en condiciones de alta intensidad luminosa con el fin de proteger la maquinaria fotosintética en condiciones de estrés lumínico (el denominado quenching no fotoquimico).

 

Fig.3. Ciclo de las Xantofilas. La interconversión entre violaxantina y zeaxantina (a través de la anteroxantina) es importantísimo en la fotoprotección de las plantas, y se ha demostrado una función importante en la disipación de energía en forma de calor bajo condiciones de alta intensidad luminosa (Demmig-Adams y Adams 1992). Esta disipación de energía se determina como quenching no fotoquímico (NPQ), considerado como un marcador del exceso de energía de excitación (Maxwell y Johnson, 2000). (Reproducido de Taiz y Zieger 2010).

Fig.3. Ciclo de las Xantofilas. La interconversión entre violaxantina y zeaxantina (a través de la anteroxantina) es importantísimo en la fotoprotección de las plantas, y se ha demostrado una función importante en la disipación de energía en forma de calor bajo condiciones de alta intensidad luminosa (Demmig-Adams y Adams 1992). Esta disipación de energía se determina como quenching no fotoquímico (NPQ), considerado como un marcador del exceso de energía de excitación (Maxwell y Johnson, 2000). (Reproducido de Taiz y Zieger 2010).

 

Regeneración del ASC

La oxidación del ASC da lugar a un radical libre tipo semiquinona, el radical libre ascorbato también denominado monodeshidroascorbato (MDHA). El MDHA puede desproporcionarse y producir una molécula de ASC y una molécula de ácido deshidroascórbico (DHA). El DHA puede transformarse de forma no enzimática en ácido 2,3-dicetogulónico, que no puede ser reciclado hasta ASC, siendo catabolizado posteriormente por la célula.

El MDHA es reciclado hasta ASC por acción de la enzima Monodeshidroascorbato reductasa (MDHAR), que usa NAD(P)H como poder reductor, mientas que el DHA es reducido a ASC por acción de la enzima Deshidroascorbatoreductasa (DHAR) en una reacción dependiente de glutatión reducido (GSH). Estas enzimas, junto con la APX y la Glutatión reductasa (GR), enzima que recicla el GSH, forman parte del denominado Ciclo ASC-GSH (o ciclo Halliwell-Asada-Foyer), cuya función es la de eliminar el H2O2 y regenerar los antioxidantes ASC y GSH (Fig 4) (Foyer y Halliwell, 1976; Asada 1999).

Fig. 4. Ciclo Ascorbato-Glutatión (ASC-GSH) presente en diferentes compartimentos celulares en células vegetales.

Fig. 4. Ciclo Ascorbato-Glutatión (ASC-GSH) presente en diferentes compartimentos celulares en células vegetales.

 

Referencias

    • Asada K (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 601-639.
    • Bartoli et al (2000) Plant Physiol. 123: 335-344.
    • Burns J.J. (1959) Amer. J. Med. 26:740-748.
    • Demmig-Adams B, Adams III WW (1992) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 599–626.
    • De Tullio y Arrigoni (2003) Seed Sci Res 13: 249-260.
    • Gest et al (2013) J Exp Bot64: 33–53
    • Foyer y Halliwell (1976) Planta 133: 21–2.
    • Funk C (1912) J. State Med. 20:341-368.
    • Maxwell y Johnson (2000) J. Exp. Bot. 51: 659-668.
    • Prescot y John (1996) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 245-271.
    • Venkatesh y Park (2014) Botanical Studies 55:38.
    • Smirnoff et al., (2001) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52:437–67
    • Svirbely y Szent-Györgyi (1932) Nature 129: 576
    • Taiz y Zieger. Plant Physiology, fifth edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. ISBN 978-0-87893-866-7

 

 

 


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Polyamines and response to salt stress in grapevine plantlets

  • José A. Hernández Cortés, Group of Fruit Biotechnology, CEBAS-CSIC (Murcia, Spain)

A recent work, carried out in our laboratory, studied the role of polyamines in the salt stress adaptation in grapevine (Vitis vinifera L.) plantlets.

Salinity is one of the most important stress factors which limits the growth and development of plants by altering their morphological, physiological and biochemical attributes. Salinity induced a water deficit as well as an ionic toxicity in the plants resulting in an alteration in the ionic homeostasis. In addition to the osmotic and toxic effects, salt stress is also manifested as an oxidative stress, contributing all these factors to the deleterious effects of salinity in plants (Hernández et al., 2001; 2003). To mitigate and repair damage initiated by ROS, plants have developed a complex antioxidant defense system. The primary components of this system include carotenoids, ascorbate, glutathione, tocopherols and enzymes such as superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (EC 1.11.1.6), glutathione peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9), peroxidases and the enzymes involved in the ascorbate-glutathione cycle (ASC-GSH cycle; Foyer and Halliwell 1976): ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.1), dehydroascorbate reductase (DHAR, EC 1.8.5.1), monodehydroascorbate reductase (MDHAR, EC 1.6.5.4) and glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2) (Noctor and Foyer 1998).

Plant polyamines (PAs) have been suggested to play important roles in morphogenesis, growth, embryogenesis, organ development, leaf senescence, and abiotic and biotic stress responses (Kusano et al., 2008). Therefore, homeostasis of cellular PA levels is also a defensive strategy that plants have developed to cope with adverse situations (Chinnusamy et al., 2005; Groppa and Benavides, 2008). Putrescine (Put), spermidine (Spd), and spermine (Spm) are the major PA pools commonly present in higher plants and known as active oxygen scavenging compounds being considered as mediators in protective reactions against different stresses (Kovacs et al., 2010). However, PAs can also increase ROS production through its catabolism in the apoplast by the action of Cu-containing amino oxidase (CuAO) and polyamine oxidase (PAO) activities (Smith, 1985).

We studied the effect of salt stress in the presence and the absence of MGBG, an inhibitor of S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) activity, involved in PA biosynthesis, in order to investigate the effects of both treatments on photosynthesis and oxidative metabolism providing new information about the contribution of PA metabolism to salt stress adaptation in grapevine plantlets.

 

Results

Salt stress applied in the culture medium of in vitro grapevine plantlets disturbed the growth rate. The application of MGBG, an inhibitor of SAMDC, resulted in further deterioration of plant growth, especially under salt stress conditions. Leaves from salt treated plantlets developed chlorotic symptoms in the leaf margins; this effect was more evident in the presence of both treatments (Fig. 1).Figure-1

Salt stress produced an alteration in the fluorescence chlorophyll parameters in grapevine leaves. In this sense, a decrease in the photochemical quenching parameters [qP and Y(II)] and an increase in the non-photochemical parameters (qN and NPQ) was observed (Fig 2). The presence of the inhibitor MGBG had no important effect on qN, but it decreased NPQ values, as well as qP and Y(II) (Fig. 2).The effect of NaCl and MGBG on Fv/Fm was less pronounced when the measure was performed in the middle of the leaves. However, when Fv/Fm was recorded near the chlorotic areas (in the leaves margins) the effect of NaCl and/or MGBG was more noticeable (Fig. 2).

Figure-2

NaCl and MGBG treatments induced an oxidative stress as shown by the increase in lipid peroxidation level, measured as TBARS. A synergistic effect on lipid peroxidation was observed in salt-treated plantlets grown in the presence of MGBG (Fig. 3). The increase in lipid peroxidation, and therefore the damage to membrane was parallel with ROS accumulation (H2O2 and O2.-) detected by histochemical staining with DAB, or NBT, respectively (Figs. 4 and 5).

Fig-4Fig-5

 

Salt treatment affected the PA contents in grapevine plantlets, especially the free and conjugate forms of agmatine (Agm) and Put. MGBG induced also a small rise in Agm content, whereas Put, Spd and Spm levels remained relatively unchanged in non-salinized plantlets (Fig. 6). The effect of salt-stress on Agm and Put was intensified in the presence of MGBG, mainly in their free forms. Surprisingly, the level of Spd remained unaffected by MGBG whatever its form, while, a 27% decrease in bound Spm was observed in the same conditions (Fig. 6).

Fig-6

Salt-stress induced a decrease in APX activity whereas no significant effect in MDHAR was recorded (Fig. 7). However, significant increases in SOD and POX activities were induced by NaCl (Fig. 7). The incubation of grapevine plantlets in the presence of MGBG produced no effects in APX activity, whereas significant increases in MDHAR, SOD and POX were observed, and a similar situation was recorded in the presence of both treatments (NaCl plus MGBG) (Fig. 7).

Figure-7

Salt-stress slightly affected the reduced ASC contents, although a strong accumulation in oxidized ascorbate (DHA) was recorded. This effect resulted in a strong decrease in the redox state of ascorbate in NaCl-treated plants (Table 1). No effect in the reduced ASC contents was observed when grapevine plantlets were incubated with MGBG. However, a significant decrease was noticed after simultaneous incubation with NaCl and MGBG (Table 1). Surprisingly, in plants treated with MGBG, in absence or presence of NaCl, no accumulation of DHA was noticed. Even a decrease in DHA in relation to control plants occurred, and accordingly, an increase in the redox state of ascorbate (Table 1). Salt-stress also produced a decrease in reduced glutathione (GSH) both in the absence and in the presence of MGBG (Table 1). In contrast, the treatment with MGBG alone had no effect in GSH contents. No significant change in oxidised glutathione (GSSG) was produced, but due to the negative effect of NaCl in GSH, a decrease in the redox state of glutathione was observed in salt-stressed grapevine plantlets (Table 1).

 

Table 1

Results showed that MGBG treatment contribute to the deleterious effect of oxidative stress in grapevine plantlets grown in presence of NaCl, affecting different physiological and biochemical processes, including plant growth, PA levels,  photosynthesis and redox state of the cells, highlighting a possible protecting role of PA homeostasis in plants subjected to salt stress.

These results suggest that maintaining polyamine biosynthesis through the enhanced SAMDC activity in grapevine leaf tissues under salt stress conditions could contribute to the enhanced ROS scavenging activity and a protection of photosynthetic apparatus from oxidative damages.

 

 

References

  • Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK. (2005) Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Sci 45:437–448.
  • Foyer CH, Halliwell B (1976) Presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta 133: 21-25.
  • Groppa MD, Benavides MP. (2008) Polyamines and abiotic stress: recent advances. Amino Acids 2008; 34:35–45.
  • Hernández JA, Ferrer MA, Jiménez A, Ros-Barceló A, Sevilla F. (2001) Antioxidant systems and O2.-/H2O2 production in the apoplast of Pisum sativum L. leaves: its relation with NaCl-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Physiol 127:817-831.
  • Hernández JA, Aguilar A, Portillo B, López-Gómez E, Mataix Beneyto J, García-Legaz MF. (2003) The effect of calcium on the antioxidant enzymes from salt-treated loquat and anger plants. Funct Plant Biol 30:1127-1137.
  • Kovacs Z, Simon-Sarkadi L, Szücs A, Kocsy G. (2010) Different effects of cold, osmotic stress and abscisic acid on polyamine accumulation in wheat. Amino Acids 38: 623–631.
  • Kusano T, Yamaguchi K, Barberich T, Takahashi Y. (2007) The polyamine spermine rescues Arabidopsis from salinity and drought stresses. Plant Signal Behav 2:250-251.
  • Noctor G, Foyer CH. (1998) Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 249-279.
  • Smith TA.  (1985) The di- and poly-amine oxidases of higher plants. Biochem Soc Trans 13:319-322.

 

For more information, please consult:

Ikbal FE, Hernández JA, Barba-Espín G, Koussa T, Aziz A, Faize M, Diaz-Vivancos P. (2014) Enhanced salt-induced antioxidative responses involve a contribution of polyamine biosynthesis in grapevine plants. J Plant Physiol. 2014, 171:779-88. doi: 10.1016/j.jplph.2014.02.006.

 

 

 


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ROS signalling during environmental stress situations

Pedro Diaz-Vivancos, Associate Researcher (CEBAS-CSIC)

Plants are sessile forms of life and as consequence they don´t have the capacity to “escape” from unfavourable environmental situations. Thus plants often face the challenge of grow under stressful conditions such as water or light deficit or excess, low or high temperature, pathogen attack… These stresses exert adverse effects on plant growth and development by inducing many metabolic changes, such as the occurrence of an oxidative stress (Diaz-Vivancos et al., 2008; Hernández et al., 2004a,b). Oxidative stress involves the enhanced production of reactive oxygen species (ROS), such as superoxide (O2•-), hydrogen peroxide (H2O2), and hydroxyl radicals (OH.), which are some of the most damaging molecules in plants.

In plants, ROS production is kept under tight control by an efficient antioxidative system, which includes both enzymatic and non-enzymatic compounds, that modulates intracellular ROS concentration setting the cellular redox homeostasis. Among these non-enzymatic scavengers, low molecular weight compounds, including ascorbic acid (ASC) and glutathione (GSH) are involved, while the main enzymatic arsenal of ROS scavengers includes enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POX) and the ascorbate-glutathione cycle enzymes [ascorbate peroxidase (APX), dehydroascorbate reductase (DHAR), monodehydroascorbate reductase (MDHAR) and glutathione reductase (GR)]. Under environmental stress conditions antioxidants function as redox buffers that interact with ROS and act as a metabolic interface that modulate the appropriate induction of acclimation/tolerance responses (Foyer & Noctor 2005).

Acclimation of plants to changes in their environment requires a new state of cellular homeostasis achieved by a delicate balance between multiple pathways that reside in different cellular compartments. Under optimal growth conditions, ROS are mainly produced at a low level, being their rate of production drastically increased when plants are exposed to environmental stresses. Despite the fact that ROS has been considered as toxic molecules during stress conditions, recent studies have shown that ROS play a key role in plants as signal transduction molecules acting as signalling molecules that regulate stress responses, as well as growth and development (Foyer & Noctor 2005; Miller et al., 2010; Barba-Espín et al., 2011).

The next question is obvious, which ROS is the most suitable to be messenger? H2O2 is the most likely ROS to act as messenger because of its relative stability and its capacity to cross membranes, thus H2O2 is considered to play a major role in cellular signalling pathways (Foyer & Noctor 2005). Additionally, H2O2 lead to the activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs; a specific class of serine/threonine protein kinases) cascades which play a key role in plant growth and development (Barba-Espín et al., 2011) as well as in biotic and abiotic responses. Moreover, oxidized peptides could act as secondary ROS messengers regulating source specifics genes and might contribute to ROS signalling during oxidative stress (Møller & Sweetlove 2010).

The oxidative stress that accompanies environmental stresses appears now to be a key component in plant cell signalling. Therefore, the oxidative stress should not necessarily be viewed as a harmful event needed to be avoided or alleviated, but could also be viewed as a perquisite for the plant to adequately respond and induce proper acclimation mechanisms. Because it seems that ROS signalling is responsible for the activation of different acclimation responses in plants, it is easy to understand why changes in ROS metabolism were found to cause enhanced tolerance or sensitivity to stress situation (Miller et al., 2010).

ROS sognalling

References:

Barba-Espin G et al. (2011) Understanding the role of H2O2 during pea seed germination: a combined proteomic and hormone profiling approach. Plant, Cell and Environment 34: 1907-1919.

Diaz-Vivancos P et al. (2008) Alteration in the chloroplastic metabolism leads to ROS accumulation in pea plants in response to Plum pox virus. Journal of Experimental Botany 59: 2147-2160.

Foyer CH & Noctor G (2005) Redox homeostasis and antioxidant signalling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. The Plant Cell 17: 1866-1876.

Hernández JA et al. (2004a) Oxidative stress induced by long-term plum pox virus infection in peach (Prunus persica L. cv GF305). Physiologia Plantarum 122: 486-495

Hernández JA et al. (2004b) Role of hydrogen peroxide and the redox state of ascorbate in the induction of antioxidant enzymes in pea leaves under excess light stress. Functional Plant Biology 31: 359-368.

Miller G et al. (2010) Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant, Cell and Environment 33: 453-497.

Møller IM & Sweetlove LJ (2010) ROS signalling – specificity is required. Trends in Plant Science 15: 370-374.


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GLUTATHIONE: A MULTIFUNCTIONAL MOLECULE

Pedro Díaz-Vivancos. Researcher in CEBAS-CSIC

As we have already mentioned, glutathione (GSH) is one of the main non-enzymatic antioxidants compounds both in plants and animals (https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2013/07/04/antioxidant-defense-mechanisms-i-non-enzymatic-mechanisms/).

Glutathione (GSH) is a very important non-protein thiol compound (thiol is a compound which contains the functional group composed of a sulphur atom and a hydrogen atom) in many organisms. The GSH is a non-protein tripeptide composed of amino acids L-cysteine, acid L-glutamate and glycine. GSH has multiple functions:

1. It is the main endogenous antioxidant produced by cells, directly acting in the neutralization of free radicals and reactive oxygen species (ROS) and in the maintenance of endogenous antioxidant as vitamin C and E in its reduced form (active).

2. By direct conjugation, it participates in the detoxification of foreign compounds (xenobiotic) and carcinogenic agents.

3. In plants it is essential in the regulation of its development and in the responses to the environment (defence against both biotic and abiotic stresses). In animals it is essential for the proper functioning of the immune system, taking part, for example, in the modulation of the antigen presentation to lymphocytes, in lymphocytes proliferation and in the regulation of processes of apoptosis or programmed cell death.

4. It has a crucial role in numerous metabolic and biochemical reactions: DNA synthesis and reparation, protein synthesis, amino acid transport, enzymatic reactions, metabolism of sulphur etc.

Therefore, glutathione plays numerous functions, but mainly it participates in the regulation of the cellular redox state (oxidation-reduction reactions). The state of glutathione is modulated by oxidants, nutritional factors and other factors such as defence responses to pathogens, etc. For these reasons, glutathione is considered as a signalling molecule which integrates environmental information in cellular network. Nowadays, there are clear evidences that glutathione is a multifunctional metabolite in plants and animals, being fundamental in numerous cellular processes.

GSH ingles

Foods rich in GSH are asparagus, spinaches, broccoli, garlic, cabbage, onions, watercress and Brussels sprouts. Some species as cumin or cinnamon also elevate GSH levels in a modest way. Other foods, which contain glutathione in minor quantity, are melon, avocado, grapefruit, peaches, oranges, walnuts, turkey and chicken. Summing up, dairy products, cereals and bread are low in GSH; fruits and vegetables have moderate or high quantities of GSH, and meat freshly prepared has a relatively high content of GSH.

However, it is very important to mention that is much more significant to focus in foods that contain glutathione precursors than in foods which contain glutathione. That is because glutathione has a chemical structure that is weak to digestive process. Glutathione is not an essential nutrient, since it can be synthesized from amino acids L-cysteine, acid L-glutamate and glycine. Glutamic acid and glycine are in almost all foods that we eat, but cysteine is much lower, being in eggs, garlic and milk. It is recommended the consumption of foods rich in selenium, being known for helping to elevate glutathione levels.


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ASCORBATE AND EVOLUTION, THE SUCCESS OF A MOLECULE?

José A. Hernández Cortés. Scientist Researcher of CEBAS-CSIC. Group of Fruit Biotechnology.

As it was mentioned in a previous chapter (https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2013/06/21/origin-of-the-oxygen-in-the-earths-atmosphere-a-necessity-to-live-a-threat-to-the-living-organisms/), the aerobic metabolism facilitated the evolution of the multicellular organisms. The life with oxygen provided benefits in terms of metabolic diversification, since there are more than 1000 metabolic reactions which use oxygen and which are specific to the aerobic metabolism (Raymond y Segre 2006; Halliwell 2006; Falkowski 2006).

The use of oxygen entails a greater energy production; however, the oxygen is a toxic molecule since the generation of reactive oxygen species (ROS), derived from its metabolism, cannot be avoided. In view of this situation, different strategies were developed to avoid the oxygen toxicity, from the occupation of anaerobic niches to develop systems which control the distribution and concentration of oxygen. In plants, the production of ROS poses a particular problem; on the one hand, by its inability to move to safer environments, and on the other hand, because the photosynthesis process, essential in plants, favours the ROS generation.

Evolution in the antioxidant systems in plants: the ascorbic acid or vitamin C
In a recent revision (Gest et al., 2013), it is emphasised the necessity of the evolution and development of antioxidant systems to control the ROS production. These authors mention that a good antioxidant must provide protection against the oxidation (loss of electrons) by the transfer of electrons to the oxidised molecules in order to reduce them and restore a non-toxic and non-oxidised environment. Moreover, a good antioxidant must not be toxic in its oxidised form and it must be able of recycling or regenerating itself to recover its electrons from another source. In this sense, a molecule which plays a paper of excellent antioxidant is the ascorbic acid, also known as vitamin C (Foyer y Noctor 2011).

Asc,mono, DHA

This molecule can neutralize directly ROS such as hydroxyl radicals (.OH), hydrogen peroxide (H2O2). superoxide (O2.-), singlet oxygen (1O2), but it can also repair oxidised organic molecules, such as alpha-tocopherol o vitamin E. The oxidised ascorbate form, the monodehydroascorbate radical, is a very stable molecule which can be turned into another non-radical molecule, the dehydroascorbate (Smirnoff 2000). Ascorbate can be easily regenerated by the action of specific reductases and with the help of other molecules such as the NADH, the NADPH or the GSH on the so-called Ascorbate-Glutathione cycle (ASC-GSH) (see https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2013/07/12/antioxidant-defense-mechanisms-ii-enzymatic-mechanisms/).

But ascorbate is not only an excellent antioxidant, it also fulfils some functions in plants. For example, it is the great protector of the photosynthetic apparatus; it participates in the flavonoid biosynthesis, including the anthocyanins, and the ethylene and gibberellins biosynthesis. These compounds play an important function in the development and fruit ripening. Other processes in which it participates include the growth and development, the progression of the cellular cycle, seeds viability, and the germination.

Ascorbate is not as broadly present as its antioxidant “brother”, the glutathione (GSH). In this sense, ascorbate is absent in bacteria; while they can use it as a carbon source, they cannot synthesise it (Yew y Gerlt 2002). Cyanobacteria, precursors of the chloroplasts, have very little ascorbate or else it is absent, whereas higher plants gathered more ascorbate in all its cellular compartments and in all its organs. The fruit is a source of vitamin C particularly important that you should to consume due to its huge benefits for health, since human beings cannot biosynthesize it.

 

Foods rich in ascorbic acid

Foods rich in ascorbic acid

 

References

  • Falkowski PG (2006) Evolution. Tracing oxygen’s imprint on earth’s metabolic evolution. Science 311, 1724–1725.
  • Gest N, Gautier H, Stevens R (2013) Ascorbate as seen through plant evolution: the rise of a successful molecule? Journal of Experimental Botany 64, 33-53.
  • Foyer CH, Noctor G (2011) Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub. Plant Physiology 155, 2–18.
  • Halliwell B (2006) Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiology 141, 312–322.
  • Raymond J, Segre D (2006) The effect of oxygen on biochemical networks and the evolution of complex life. Science 311, 1764–1767.
  • Smirnoff N (2000) Ascorbic acid: metabolism and functions of a multi-facetted molecule. Current Opinion in Plant Biology 3, 229–235.
  • Yew WS, Gerlt JA (2002) Utilization of L-ascorbate by Escherichia coli K-12: assignments of functions to products of the yjf-sga and yiasgb operons. Journal of Bacteriology 184, 302–306.