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Plant ROS Research


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Fluorescencia de clorofilas

José A. Hernández, Grupo de Biotecnología de Frutales (CEBAS-CSIC)

La fluorescencia es un fenómeno foto-físico de las moléculas de clorofila que permite estudiar la función del fotosistema II (PSII) durante el transporte electrónico en la fotosíntesis y la sensibilidad del PSII al daño que puede sufrir por efecto de diferentes estreses, y las consecuencias que esto tiene en el proceso global de la fotosíntesis (Figura 1).

Por tanto, la fluorescencia de clorofilas es una técnica muy útil que permite hacer un seguimiento al proceso de fotosíntesis en general. Se emplea en diferentes estudios:

  •  Fisiología de la fotosíntesis
  • Ecofisiología
  • Biología Marina y Acuática
  • Horticultura
  • Agricultura
  • Fisiología de Post-cosecha
  • Mejora Vegetal
  • Genética

¿Qué es la fluorescencia?

Los electrones que forman parte de un átomo o una molécula tienden a permanecer en un estado de menor energía (estado fundamental). Si un átomo absorbe un fotón con suficiente energía, un electrón puede saltar a un orbital de mayor energía. Este estado de mayor energía es más reactivo que el estado fundamental y puede participar en reacciones químicas que son imposibles para el estado fundamental. Esto es muy importante para la fotosíntesis. Incluso en ausencia de reacciones, el estado excitado es inestable y puede volver a sus estado fundamental por diferentes vías, incluido la emisión de un fotón. El fotón emitido es la fluorescencia.

Figura 1. Esquema en Z de la cadena de transporte de electrones en el cloroplasto.

Figura 1. Esquema en Z de la cadena de transporte de electrones en el cloroplasto.

La energía luminosa absorbida por las moléculas de clorofila en la hoja tiene tres posibles destinos: La mayor parte se va a usar en fotosíntesis (energía fotoquímica). Una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia) con el fin de que el exceso de energía no dañe a los fotosistemas. La cantidad de energía emitida como fluorescencia es muy pequeña (1-2% del total de luz absorbida) (Figura 2).

Figura 2. Esquema mostrando el uso de la energía luminosa en condiciones fisiológicas. La mayor parte se va a usar en fotosíntesis y una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia).

Figura 2. Esquema mostrando el uso de la energía luminosa en condiciones fisiológicas. La mayor parte se va a usar en fotosíntesis y una pequeña parte de la energía, la que no puede emplearse en fotosíntesis, se disipa en forma de calor o bien puede ser re-emitida como luz (en forma de fluorescencia).

En condiciones normales, la fotosíntesis predomina sobre los otros procesos, pero en condiciones de estrés, la planta no puede trabajar a pleno rendimiento y el exceso de energía debe disiparse. Como consecuencia, los procesos no fotoquímicos aumentan.

Para un análisis de fluorescencia es conveniente adaptar a la planta a condiciones de oscuridad durante unos 10-15 minutos. Cuando una hoja se transfiere desde la oscuridad a la luz, los centros de reacción del PSII se van cerrando progresivamente. Esto da lugar a un aumento en el rendimiento de la fluorescencia de las clorofilas. A partir de este momento, los niveles de fluorescencia disminuyen de nuevo. Este fenómeno se conoce como quenching y se explica  de dos maneras: Primero, se produce un incremento en la tasa de transporte de electrones fuera del PSII. Esto es debido a la activación mediada por luz de los enzimas implicados en el metabolismo del carbono y en la apertura de los estomas. Este tipo de quenching se denomina “quenching fotoquímico”. Al mismo tiempo, se produce un aumento de la eficiencia en la que la energía se convierte en calor. Este último proceso se denomina “quenching no fotoquímico” (NPQ).

Para el análisis de la fluorescencia de clorofilas se han definido y calculado diferentes coeficientes para cuantificar el quenching fotoquímico y no fotoquímico. Para los procesos fotoquímicos, el parámetro más útil para medir la eficiencia del PSII es el rendimiento cuántico del PSII (ØPSII o Y(II)), que mide la proporción de luz absorbida por la clorofila asociada al PSII  que es usada en procesos fotoquímicos. Otro parámetro ampliamente usado es el quenching fotoquímico (qP).  Aunque es muy similar al ØPSII , el significado del qP es algo diferente. En este caso, el qP hace referencia a la proporción de centros de reacción del PSII que están abiertos. ØPSII y qP están interrelacionados con un tercer parámetro, Fv/Fm, que mide la eficiencia del PSII, es decir, mide el rendimiento cuántico si todos los centros de reacción del PSII estuviesen abiertos.

Los procesos no fotoquímicos (NPQ) están relacionados con la disipación de calor, y su escala varía desde 0 hasta el infinito. El NPQ tiene varios componentes, pero el más importante es el denominado qN (coeficiente del quenching no fotoquímico). Este parámetro varía en una escala desde 0 a 1 y está relacionado con la disipación de calor mediante el ciclo de las xantofilas (Fig 3). NPQ y qN son indicadores de estrés y han demostrado ser parámetros muy sensibles para la detección temprana de condiciones de estrés mediante imagen de fluorescencia. En este sentido se pueden usar para valorar situaciones de estrés abiótico como biótico, pudiendo analizar el efecto de estreses ambientales en el cloroplasto, incluso antes de que se observen señales de síntomas en las hojas (Fig 4).

Figura 3. Esquema del ciclo de las Xantofilas. La interconversión de anteroxantina en zeaxantina lleva asociada una disipación de energía en forma de calor.

Figura 3. Esquema del ciclo de las Xantofilas. La interconversión de anteroxantina en zeaxantina lleva asociada una disipación de energía en forma de calor.

Figura 4. Efecto del estrés hídrico sobre los parámetros qP y qN. Las plantas 1,2 y 3 se sometieron a un periodo de falta de riego de 15 días. Las imágenes muestran cómo el estrés reduce el valor de qP, pero de forma más dramática en plantas 1 y 2. Por el contrario, la sequía aumenta la disipación de calor (qN) en las plantas 1 y 2 con el fin de poder minimizar daños por exceso de energía luminosa. La planta 3 presenta sólo una pequeña variación en qN.

Figura 4. Efecto del estrés hídrico sobre los parámetros qP y qN. Las plantas 1,2 y 3 se sometieron a un periodo de falta de riego de 15 días. Las imágenes muestran cómo el estrés reduce el valor de qP, pero de forma más dramática en plantas 1 y 2. Por el contrario, la sequía aumenta la disipación de calor (qN) en las plantas 1 y 2 con el fin de poder minimizar daños por exceso de energía luminosa. La planta 3 presenta sólo una pequeña variación en qN.

Para más información:

  • Maxwell K, Johnson GN (2000) Chlorophyll fluorescence – a practical guide. J. Exp. Bot. 51: 659-668.
  • Pérez-Bueno ML, Ciscato M, vandeVen M, Gacía-Luque I, Valcke R, Barón M (2006) Imaging viral infection: studies on Nicotiana benthamiana plants infected with the pepper mild mottle tobamovirus. Photosyntesis Research 90:111–123.
  • Taiz L, Zeiger E (2010) Plant  Physiology, Fifth Edition, Sinauer Associates Inc., Publishers, Sinderland, Massachusetts, USA


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GLUTATHIONE: A MULTIFUNCTIONAL MOLECULE

Pedro Díaz-Vivancos. Researcher in CEBAS-CSIC

As we have already mentioned, glutathione (GSH) is one of the main non-enzymatic antioxidants compounds both in plants and animals (https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2013/07/04/antioxidant-defense-mechanisms-i-non-enzymatic-mechanisms/).

Glutathione (GSH) is a very important non-protein thiol compound (thiol is a compound which contains the functional group composed of a sulphur atom and a hydrogen atom) in many organisms. The GSH is a non-protein tripeptide composed of amino acids L-cysteine, acid L-glutamate and glycine. GSH has multiple functions:

1. It is the main endogenous antioxidant produced by cells, directly acting in the neutralization of free radicals and reactive oxygen species (ROS) and in the maintenance of endogenous antioxidant as vitamin C and E in its reduced form (active).

2. By direct conjugation, it participates in the detoxification of foreign compounds (xenobiotic) and carcinogenic agents.

3. In plants it is essential in the regulation of its development and in the responses to the environment (defence against both biotic and abiotic stresses). In animals it is essential for the proper functioning of the immune system, taking part, for example, in the modulation of the antigen presentation to lymphocytes, in lymphocytes proliferation and in the regulation of processes of apoptosis or programmed cell death.

4. It has a crucial role in numerous metabolic and biochemical reactions: DNA synthesis and reparation, protein synthesis, amino acid transport, enzymatic reactions, metabolism of sulphur etc.

Therefore, glutathione plays numerous functions, but mainly it participates in the regulation of the cellular redox state (oxidation-reduction reactions). The state of glutathione is modulated by oxidants, nutritional factors and other factors such as defence responses to pathogens, etc. For these reasons, glutathione is considered as a signalling molecule which integrates environmental information in cellular network. Nowadays, there are clear evidences that glutathione is a multifunctional metabolite in plants and animals, being fundamental in numerous cellular processes.

GSH ingles

Foods rich in GSH are asparagus, spinaches, broccoli, garlic, cabbage, onions, watercress and Brussels sprouts. Some species as cumin or cinnamon also elevate GSH levels in a modest way. Other foods, which contain glutathione in minor quantity, are melon, avocado, grapefruit, peaches, oranges, walnuts, turkey and chicken. Summing up, dairy products, cereals and bread are low in GSH; fruits and vegetables have moderate or high quantities of GSH, and meat freshly prepared has a relatively high content of GSH.

However, it is very important to mention that is much more significant to focus in foods that contain glutathione precursors than in foods which contain glutathione. That is because glutathione has a chemical structure that is weak to digestive process. Glutathione is not an essential nutrient, since it can be synthesized from amino acids L-cysteine, acid L-glutamate and glycine. Glutamic acid and glycine are in almost all foods that we eat, but cysteine is much lower, being in eggs, garlic and milk. It is recommended the consumption of foods rich in selenium, being known for helping to elevate glutathione levels.