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Plant ROS Research


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Metabolismo antioxidante y fluorescencia de clorofila durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas micropropagadas de Stevia rebaudiana Bertoni

En un trabajo reciente, publicado por el grupo del Dr. José A. Hernández en cooperación con el Dr. Abel Piqueras, se ha comprobado que las enzimas antioxidantes, la fluorescencia de clorofila y los niveles de peroxidación lipídica (un parámetro de estrés oxidativo)  pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de plantas micropropagadas de stevia durante la aclimatación a condiciones ex vitro. Estos parámetros proporcionan información muy útil para monitorizar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada para la producción de edulcorantes y antioxidantes naturales para la dieta.

Plantas

Fases de la aclimatación de las plantas de stevia. A: Multiplicación; B: Enraizamiento: C: 2 dias aclimatación; D: 2 semanas aclimatación; E: 4 semanas aclimatación

Introducción

La aplicación de técnicas de cultivo in vitro es una poderosa herramienta de proliferación vegetativa para muchas especies vegetales [Van-Huylenbroeck et al 2000]. Sin embargo, este proceso puede limitarse debido a pérdidas significativas durante la aclimatación a condiciones ex vitro. La mejora de la actividad fotosintética es un paso crítico para alcanzar una alta tasa de supervivencia durante la aclimatación de las plántulas in vitro [Carvalho et al 2001]. En otras palabras, la activación adecuada de la fotosíntesis es el punto clave para cambiar la forma de adquirir carbono de fuentes heterotróficas o mixotróficas (condiciones in vitro) a fuentes autotróficas (condiciones ex vitro). Las plantas micropropagadas son muy susceptibles a las condiciones ambientales después de la transferencia a condiciones ex vitro. Por ejemplo, las plantas ex vitro normalmente están expuestas  a una mayor intensidad luminosa que las plantas cultivadas en condiciones in vitro. Además, la humedad relativa (HR) también es menor en condiciones ex vitro, por lo que las plantas son propensas a sufrir desecación durante la aclimatación. Ambos fenómenos, que contribuyen al daño por fotoinhibición y al estrés hídrico, pueden inducir la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, las plantas cuentan con un mecanismo eficiente de defensa antioxidante para defenderse de los efectos nocivos de ROS. Estas defensas incluyen las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (ASC-GSH) (ascorbato peroxidasa (APX), monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), deshidroascorbato reductasa (DHAR) y glutatión reductasa (GR)) y enzimas captadoras de ROS (superóxido dismutasas (SOD), peroxidasas (POX) y catalasa (CAT). El conocimiento sobre el comportamiento de la maquinaria antioxidante durante la aclimatación ex vitro es muy escaso, y solo unos pocos investigadores han estudiado los cambios en los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos durante este proceso [Van-Huylenbroeck et al 2000; Carvalho et al 2006; Dewir et al 2015; El-Mahrouk et al 2016].

La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es un arbusto perenne perteneciente a la familia Asteraceae. Las hojas de S. rebaudiana contienen una alta concentración de esteviol glucósidos, siendo las formas prevalentes el esteviósido y el rebaudiósido A, empleados como edulcorantes naturales como sustitutos de la sacarosa [Zeng et al 2006]. Sin embargo, las semillas de stevia tienen poca viabilidad y la planta requiere condiciones específicas de humedad, luz y nutrientes. La acumulación de esteviol glucósidos en S. rebaudiana es muy variable debido a la variabilidad genética. El contenido total de esteviol glucósidos es diferente no solo entre plantas del mismo cultivar, sino también entre plantas similares en la misma etapa de desarrollo [Ceunen et al 2007]. Además, se ha observado una alta capacidad antioxidante de los extractos de hojas de S. rebaudiana, relacionados con su función como captadores de ROS [Ceunen et al 2007; Ghanta et al 2007). Estas funciones positivas se han asociado principalmente con la presencia de compuestos fenólicos [Ceunen et al 2007]. Además, se han descritos efectos positivos del esteviósido relacionados con la diabetes tipo II, la hipertensión, el síndrome metabólico y la aterosclerosis [Ceunen et al 2007]. Por lo tanto, la producción de plantas clonales in vitro con un perfil de esteviósido similar puede ser de interés comercial.

En consecuencia, este trabajo se ha centrado en la aclimatación a las condiciones ex vitro de clones de stevia, originada a partir de la micropropagación de plantas previamente caracterizadas como altos acumuladores de esteviol glucósidos [Cantabella et al 2017]. Durante el proceso de aclimatación, se siguió la evolución de diferentes parámetros, incluido el metabolismo antioxidante, la peroxidación lipídica como parámetro de estrés oxidativo y la fluorescencia de clorofila, para determinar el estrés oxidativo que las plantas de stevia podrían estar sufriendo durante el proceso antes mencionado.

Resultados y Discusión

Durante las primeras horas del proceso de aclimatación, las plantas de stevia parecían experimentar estrés debido a la modificación de las condiciones de cultivo, como se observa por el aumento en los niveles de peroxidación lipídica, medidos como TBARS. En ese sentido, se detectó un pico después de 2 días, aumentando en un 86% con respecto a los valores en la plántula (Figura 1). Posteriormente, y a medida que avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro, los valores de peroxidación lipídica disminuyeron progresivamente hasta alcanzar los valores iniciales (Figura 1). Por lo tanto, se produjo un estrés oxidativo durante las primeras horas de aclimatación, indicando un posible daño a las membranas como consecuencia del cambio de condiciones de cultivo.

Fig 1

Fig 1. Datos de peroxidación de lípidos durante la aclimatación de plantas de stevia

Respecto al comportamiento de las enzimas antioxidantes,   observamos una actividad menor de la enzima monodehidroascorbato reductasa (MDHAR) que la enzima dehidroascorbato reductasa (DHAR) después de 2 días de aclimatación. Sin embargo, después de 7 días de aclimatación, las plantas de stevia activaron la ruta MDHAR para reciclar el ascorbato, que es mucho más eficiente, desde un punto de vista energético, que la ruta DHAR (Figura 2).

Fig 2

Figura 2. Evolución de las enzimas del ciclo ASC-GSH durante el procesod e aclimatación de plantas de stevia

En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, la relación DHAR / MDHAR era casi 2. Esto sugiere que, en esa etapa, la actividad de DHAR era la vía predominante en el reciclaje de ascorbato en plantas de stevia, utilizando GSH como donante de electrones. Posteriormente, DHAR disminuyó y MDHAR aumentó progresivamente, alcanzando una relación DHAR / MDHAR de 0.22 después de 28 días de aclimatación, donde la actividad de MDHAR fue casi 5 veces mayor que la actividad de DHAR. Por lo tanto, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia utilizaron la forma MDHAR, empleando NADH como poder reductor. Es necesario aclarar que la utilización de NADH para reciclar el ASC es más eficiente energéticamente que el uso de GSH. Por lo tanto, se pueden especular diferentes posibilidades para explicar la mayor actividad de DHAR en condiciones in vitro y después de 2 días de aclimatación. La primera es que, en condiciones in vitro, los medios de cultivo contenían sacarosa, por lo que las plantas tenían suficiente fuente de carbono para generar energía a través de la glucólisis y de la respiración, y por lo tanto pueden permitirse el uso de GSH para reciclar ASC (la “forma ineficiente”). La segunda posibilidad es que después de 2 días del proceso de aclimatación, las plantas sufrieron un estrés oxidativo, según los datos de peroxidación lipídica. Dado que la sobreexpresión de DHAR se ha asociado con la tolerancia al estrés ambiental [Eltayeb et al 2006], la mayor actividad de DHAR observada en esta etapa podría tener una función para hacer frente al estrés resultante de las condiciones de aclimatación. La tercera explicación está relacionada con el papel de DHAR en el crecimiento y desarrollo de las plantas [Potters et al 2012]. Probablemente, después de 2 días de aclimatación, el aumento de DHAR podría tener una función en los procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas. También observamos que la actividad de MDHAR aumentó después de 7 días de aclimatación. En esta etapa, la fotosíntesis parecía funcionar correctamente, como lo observan los valores de fluorescencia de clorofila y ETR. Por lo tanto, a partir de ese momento, las plantas produjeron sus propios azúcares y energía para apoyar el crecimiento de las plantas. Probablemente, por esta razón, las plantas cambiaron la forma de reciclar el ascorbato de una manera eficiente, a través de NADH.

La actividad GR se comportó de manera similar a la actividad MDHAR. En ese sentido, GR aumentó a medida que avanzó el proceso de aclimatación de las plantas, alcanzando sus valores máximos después de 21 y 28 días de aclimatación (incrementos de 4.2 y 3.2 veces, respectivamente) (Figura 2).

Las actividades superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) mostraron un pico de actividad después de 7 días de aclimatación (Figura 3), lo que sugiere una protección contra las ROS (especies reactivas de oxígeno) que se podrían estar generando como consecuencia del cambio de cultivo in vitro a ex vitro. La actividad peroxidasa (POX) aumentó aproximadamente 2 veces después de 2 días de aclimatación y permaneció alta hasta el día 14 (Figura 3), probablemente relacionada con el endurecimiento de la pared celular y los procesos de lignificación.

Fig 3

Figura 3. Evolución de las enzimas SOD, CAT y POX durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Después de 2 días de aclimatación, las plantas mostraron valores más altos de los parámetros de quenching no fotoquímico [Y (NPQ), Y (NO), NPQ y qN] y valores bajos de los parámetros de quenching fotoquímico [Y (II), qP] (Figura 4), así como de la velocidad de transporte de electrones (ETR) (Figura 5). Durante el proceso de aclimatación, se observó una disminución progresiva en los parámetros de quenching no fotoquímicos y un aumento constante en los parámetros de quenching fotoquímico. En ese sentido, Y (NPQ) disminuyó progresivamente, reduciendo sus valores en un 40% y 50% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). Paralelamente, Y (NO) disminuyó durante el ensayo de aclimatación, alcanzando una disminución cercana al 40% y 30% después de 21 y 28 días de aclimatación, respectivamente (Figura 4). NPQ muestra aumentos y disminuciones durante el proceso de aclimatación. Al principio, después de 7 días de aclimatación, este parámetro aumentó en un 22%. Luego, el valor NPQ aumentó en un 63% después de 14 días de aclimatación en relación con el valor precedente (día 7). Una semana después (día 21), nuevamente el valor NPQ aumentó en un 29% en comparación con el valor observado en la segunda semana (14 días). Finalmente, después de 28 días de aclimatación, se observó una disminución del 30% en el parámetro NPQ en relación con el valor observado después de 21 días (Fig. 4). Sin embargo, aunque los valores de qN disminuyeron durante el proceso de aclimatación, los cambios producidos no fueron estadísticamente significativos (Figura 4). Tanto NPQ como Y (NPQ) están relacionados con la energía disipada como calor por un mecanismo regulado (es decir, el ciclo de xantofila) [Zhang et al 2012]. En contraste, Y (NO) refleja la fracción de energía disipada pasivamente como calor y fluorescencia, principalmente debido a los centros de reacción del PSII cerrados. Por lo tanto, los valores altos de Y (NO) están relacionados con la incapacidad de las plantas para protegerse del exceso de luz. En ese sentido, después de 2 días de aclimatación, las plantas de stevia mostraron los valores más altos de Y (NO), que disminuyeron progresivamente durante el proceso de aclimatación, lo que refleja una mejor regulación [Klughammer et al 2008]. Por otro lado, valores altos de los parámetros de quenching no fotoquímicos indicaban que las plantas estaban sufriendo un estrés. Sin embargo, a medida que la planta se adaptaba a las nuevas condiciones ex vitro, estos parámetros disminuyeron.

Fig 4

FIgura 4. Evolución de los parámetros de fluorescencia de clorofilas durante el proceso de aclimatación de plantas de stevia

Con respecto a los parámetros de quenching fotoquímico (Y (II) y qP), se produjo un aumento progresivo durante la aclimatación. En ambos casos, los valores aumentaron cerca de 3 veces después de 7 y 14 días de aclimatación, y aproximadamente 5 veces después de 21 y 28 días del proceso (Figura 4). Fv / Fm mostró los valores más bajos después de 2 días de aclimatación. Este parámetro aumentó después de 7 y 14 días, y luego disminuyó ligeramente después de 21 y 28 días de aclimatación, pero sus valores permanecieron estadísticamente más altos que los valores iniciales (Tabla 1). Los cambios observados en Y (II) y qP se correlacionaron con la evolución de los valores de ETR, alcanzando un aumento de casi 6 veces al final (28 días) del proceso de aclimatación (Figura 5). Esta respuesta de los parámetros de fluorescencia de clorofilas indicaba una mayor eficiencia fotosintética conforme avanzaba el proceso de aclimatación a las condiciones ex vitro.

Fig 5

Figura 5. Evolución de la tasa de transporte electrónico durante el proces de aclimatación de plantas de stevia

Conclusiones

En conjunto, los datos sugirieron que las enzimas antioxidantes, la peroxidación lipídica y los parámetros de fluorescencia de clorofila pueden ser herramientas adecuadas para la evaluación del estado fisiológico de las plantas micropropagadas durante la aclimatación a condiciones ex vitro de plantas de stevia, proporcionando información muy útil para controlar el estado de estrés de las plantas durante el proceso de aclimatación. Este trabajo tiene implicaciones prácticas, ya que las plantas clonales de stevia con un perfil conocido y estable de esteviol glucósidos son una fuente adecuada de edulcorantes y antioxidantes naturales para una dieta sana.

Para más información:

José Ramón Acosta-Motos, Laura Noguera Vera, Gregorio Barba-Espín, Abel Piqueras, José A. Hernández (2019) Antioxidant metabolism and chlorophyll fluorescence during the acclimatisation to ex vitro conditions of micropropagated Stevia rebaudiana Bertoni plants. Antioxidants, Special Issue “Antioxidants and Foods”, 8, 615.  (https://www.mdpi.com/2076-3921/8/12/615)

 

Bibliografía

Cantabella, D.; Piqueras, A.; Acosta-Motos, J.R.; Bernal-Vicente, A.; Hernandez, J.A.; Diaz-Vivancos, P. Salt-tolerance mechanisms induced in Stevia rebaudiana Bertoni: effects on mineral nutrition, antioxidative metabolism and steviol glycoside content. Plant Physiol. Biochem. 2017, 115, 484–496.

Carvalho, L.C.; Osorio, M.L.; Chaves, M.M.; Amâncio S. Chlorophyll fluorescence as an indicator of photosynthetic functioning of in vitro grapevine and chestnut plantlets under ex vitro acclimatization. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2001, 67, 271–280.

Carvalho, L.C.; Vilela, B.J.; Vidigal, P.; Mullineaux, P.M.; Amâncio, S. Activation of the ascorbate-glutathione cycle is an early response of micropropagated Vitis vinifera L. explants transferred to ex vitro. Int. J. Plant Sci. 2006, 167, 759-770.

Ceunen, S.; Geuns, J.M.C. Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1201−1228.

Dewir, Y.H.; El-Mahrouk, M.E.; Al-Shmgani, H.S.; Rihan, H.Z.; Teixeira da Silva, J.A.; Fuller, M.P. Photosynthetic and biochemical characterization of in vitro-derived African violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl) plants to ex vitro conditions. J. Plant Interact. 2015, 10, 101-108.

El-Mahrouk, M.E.; Dewir, Y.H.; Murthy, H.N.; Rihan, H.Z.; Al-Shmgani, H.S.; Fuller, M.P. Effect of photosynthetic photon flux density on growth, photosynthetic competence and antioxidant enzymes activity during ex vitro acclimatization of Dieffenbachia cultivars. Plant Growth Regul. 2016, 79, 29–37.

Eltayeb, A.E.; Kawano, N.; Badawi, G.H.; Kaminaka, H.; Sanekata, T.; Morishima, I.; Shibahara, T.; Inanaga, S.; Tanaka, K. Enhanced tolerance to ozone and drought stresses in transgenic tobacco overexpressing dehydroascorbate reductase in cytosol. Physiol. Plant. 2006, 127, 57–65.

Ghanta, S.; Banerjee, A.; Poddar, A.; Chattopadhyay, S. Oxidative DNA Damage Preventive Activity and Antioxidant Potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a Natural Sweetener. J. Agr.Food Chem. 2007, 55, 10962-10967.

Klughammer, C.; Schreiber, U. Complementary PSII quantum yields calculated from simple fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the saturation pulse method. PAM Application Notes (PAN) 2008, 1, 27-35

Potters, G.; Horemans, N.; Caubergs, R.J.; Asard, H. Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension. Plant Physiol. 2012, 124, 17-20.

Van-Huylenbroeck, J.M.; Piqueras, A.; Debergh, P.C. The evolution of photosynthetic capacity and the antioxidant enzymatic system during acclimatization of micropropagated Calathea plants. Plant Sci. 2000, 155, 59-66.

Zeng, J.; Cheng, A.; Lim, D.; Yi, B.; Wu, W. Effects of salt stress on the growth, physiological responses, and glycoside contents of Stevia rebaudiana Bertoni. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5720-5726.

Zhang, Q.Y.; Wang, L.Y.; Kong, F.Y.; Deng, Y.S.; Li, B.; Meng, Q.W. Constitutive accumulation of zeaxanthin in tomato alleviates salt stress-induced photoinhibition and photooxidation. Physiol. Plant. 2012, 146, 363–373.

 


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Desarrollo de un sistema electrónico “low-cost” para la medida de la fluorescencia de clorofilas en plantas

El grupo de Biotecnología de Frutales está participado de nuevo en la sexta Edición del Proyecto IDIES. El Dr. José A. Hernández (CEBAS-CSIC) ha trabajado en cooperación con el Dr. Juan Suardiaz (Profesor Titular del Departamento de Tecnología Electrónica, UPCT) y los alumnos del IES Alcántara, Jorge Parra García y Jordi Germán Calle León. Su tutora en el IES Alcántara fue la profesora Teresa de Jesús García.

El objetivo final del  proyecto fue el desarrollo de un sistema electrónico de bajo coste basado en Arduino, que permita detectar la emisión de fluorescencia de clorofilas y compararlo con un equipo profesional (IMAGIM-PAM, M-series, Heinz Walz, Effeltrich, Germany).

fluorimetro

caja 1

Arriba: Equipo IMAGIM-PAM, M-series, Walz. Abajo: Prototipo Low-Cost

Hemos comparado el prototipo fabricado (coste aproximado 100 €) con el equipo profesional (30000 €) en plantas sometidas a estrés salino. De forma cualitativa y cuantitativa, su funcionamiento es parecido al equipo profesional cuando las hojas se iluminan con luz roja (660 nm) e infrarroja cercana (850 nm), en relación con los parámetros de quenching no fotoquímico [Y(NPQ), NPQ y qN].

plantas C y 150 mm NaCl

Plantas de guisante usadas en el experimento

La respuesta que produce el equipo “Low-Cost” consiste en la propia fluorescencia de las clorofilas de las hojas. El equipo tiene luces led azules y rojas, cuyas ondas rebotan en las hojas y son de nuevo recogidas por un fotorreceptor colocado justo encima de la fuente de luz. Los datos de este receptor pasan al ordenador en una escala de 0 a 1023 bits, que son los datos que obtenemos, los cuales pueden ser transformados en µmoles de fotones m-2 s-1.

fluorescencia NaCl 150 mM

A la izquierda, resultados obtenidos con el Fluorímetro profesional, donde podemos observar un aumento de los parámetros de quenching no fotoquímico. A la derecha, los resultados numéricos (en bits) obtenidos con el prototipo low-cost.

En conclusión, este trabajo muestra como la técnica de fluorescencia de clorofilas es muy útil para valorar tanto situaciones de estrés abiótico como biótico, pudiendo analizar el efecto de dichos estreses en el cloroplasto, incluso antes de que se observen señales de síntomas en las hojas.

Estos resultados se presentarán en el VI Congreso IDIES, que se celebrará el próximo día 25 de junio de 2019 en el Palacio de Congresos Victor Villegas.


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LA FOTOSINTESIS: ORIGEN

José A. Hernández 

La teoría de la evolución más aceptada de Oparin-Haldane, sugiere  que las primeras células eran heterótrofas y que evolucionaron en las condiciones de atmósfera reducida (ausencia de oxígeno) existentes en la Tierra en ese momento. Estos simples organismos heterótrofos eran unicelulares y sobrevivían a partir de compuestos orgánicos presentes en el fondo oceánico. A medida que la materia orgánica comenzó a agotarse, las células evolucionaron gradualmente de ser heterótrofas a autótrofas. Este cambio permitió a las células utilizar compuestos químicos o la luz solar para sintetizar su propia materia orgánica para nutrirse. Estos nuevos organismos necesitaban únicamente compuestos inorgánicos, como el CO2, y una fuente de energía externa que les ayudara a transformarlos en compuestos orgánicos, fundamentalmente azúcares. Los primeros organismos autótrofos empleaban compuestos químicos que encontraban cerca de las chimeneas volcánicas (fumarolas), como el H2S, NH3, el Fe2+ (quimiosíntesis). Hace unos 3.500-3.200 millones de años ya habían colonizado zonas situadas más cerca de la superficie y allí encontraron una nueva fuente de energía para fabricar sus nutrientes: la luz del sol. La fotosíntesis había nacido. Hace 2.800 millones de años un grupo de bacterias llamadas cianobacterias desarrolló la habilidad de emplear el agua como donante de electrones en la fotosíntesis para elaborar sus nutrientes. Y como consecuencia de su actividad, comenzaron a emitir a la atmósfera el gas más tóxico y letal que existe: el Oxígeno, que es en sí mismo un radical libre pudiendo aceptar electrones de uno en uno favoreciendo la aparición de especies reactivas del oxígeno (ROS). Para más información: (https://cienciacebas.wordpress.com/2012/10/23/origen-del-oxigeno-en-la-atmosfera-terrestre-un-necesidad-para-vivir-una-amenaza-para-los-organismos-vivos/), y https://cienciacebas.wordpress.com/2012/11/05/especies-reactivas-del-oxigeno-amigos-o-enemigos/.

Las cianobacterias, mediante un proceso de endosimbiosis,  fueron las precursoras de los cloroplastos, permitiendo la evolución del Reino Plantae. El reino de las plantas engloba tres grupos de organismos fotosintéticos: Plantas y Algas Verdes (Chlorobionta), Algas Rojas (Rhodophyta) y Glaucófitos (Glaucophyta). Los tres grupos poseen plastidios (cloroplastos) derivados de una endosimbiosis primaria, es decir, mediante la adquisición de un organismo procariota y la posterior reducción de su genoma. Estudios moleculares basados en genes plastidiales y en la organización genómica de los plastidios corroboran la monofilia de este grupo y relacionan los plastidios con las cianobacterias (Ruiz-Trillo 2012). Probablemente, el origen de los plastos primarios por endosimbiosis esté asociado estrechamente al origen del linaje Plantae. La endosimbiosis se define como una asociación interespecífica en el cual uno de los simbiontes reside en el interior (endosimbionte) del otro (hospedador).

Este hecho indicaría que la fotosíntesis tiene un origen único y común en los eucariotas. Estudios moleculares señalan el origen de las plantas verdes (Chlorobionta o Viridiplantae) en la era Precámbrica, hace alrededor de 1000 millones de años, si bien se han encontrado fósiles anteriores (de hace 1400 millones de años) que podrían ser atribuidos a ancestros de los clorobiontes (Pedroche 2012).

Podemos definir el término clorobionte [del griego khloros (verde claro) y bion (vivir)] como seres con núcleo (eucariotas), autótrofos fotosintéticos caracterizados por la presencia de plastos envueltos por una doble membrana, con tilacoides compactos, presencia de clorofila a y b y con almidón intraplastidial como producto de reserva, células móviles con la presencia de dos flagelos (Pedroche 2012).

Las plantas, como organismos sésiles autótrofos, son capaces de captar energía luminosa y convertirla en energía química, que será usada como fuente de carbono. Por lo tanto, el proceso de fotosíntesis se define como la síntesis de carbohidratos por parte de las plantas verdes o por organismos pigmentados usando CO2 y agua para liberar Oxígeno molecular (O2) en presencia de luz solar.

Imagen1

Gracias al proceso de fotosíntesis es posible la vida en la tierra, ya que la vida se basa en este importante proceso, de modo que sin fotosíntesis NO habría vida, al menos como hoy la conocemos. La importancia y relevancia de este proceso en la comunidad científica es tan obvio que ha habido 10 premios Nobel a investigadores en el área de Química que han contribuido a un mejor conocimiento de la Fotosíntesis.

Premios nobel fotosintesis

Representación esquemática que representa las contribuciones significativas de los premios Nobel del campo de la fotosíntesis. Fuente: Wungrampha  et al 2018

Richard Willstatter (1915): Purificó la clorofila a y b

Hans Fischer (1930): Identificó la estructura molecular de las porfirinas, estructuras compartidas entre la clorofila y la hemoglobina.

Paul Karrer (1937): Identificó la estructura química de los carotenoides, vitamina A y C.

Richard Kuhn (1938): Descubrió los α, β, y γ-carotenos.

Melvin Calvin (1961): Describió la ruta de fijación del CO2 (Ciclo de Calvin–Benson–Bassham).

Robert Woodword (1965): Sintetizó la clorofila, la quinina, el colesterol, la cefalosporina y la colchicina.

Peter Mitchell (1978): Descubrió el mecanismo quimiostático de la síntesis del ATP.

Rudolph Marcus (1992): formuló las reacciones de tasa de transferencia de electrones (Marcus theory).

Robert Huber, Hartmut Michael, y Johann Dissenhofer (1988): Cristalizaron los complejos colectores de luz y el centro de reacción en Rhodobacter.

Paul Delos Boyer, John Ernest Walker y Jens Christian Skou (1997): Descubrieron la ATP sintasa, enzima responsable de la síntesis de ATP.

           Las contribuciones de todas estas investigaciones hizo posible poder conocer mejor el proceso de fotosíntesis. Sin embargo, queda todavía mucho para entender mejor dicho proceso con el fin de mejorar su rendimiento y la producción de alimentos. Esto adquiere una especial importancia si pensamos que la población humana podría superar los 9000 millones para 2050 y que cada vez habrá menos suelo disponible y menos agua para cultivar. Se prevé que para ese momento (año 2050), además de más población, tendremos unos 50 millones de hectáreas menos para dedicarlas al cultivo debido a las condiciones medioambientales, incluyendo la mayor salinización de suelos,  menos disponibilidad de agua y la aparición de nuevas plagas, entre otros problemas.

Bibliografía

Wungrampha S, Joshi R, Singla-Pareek SL, Areek A (2018) Photosynthesis and salinity: are these mutually exclusive? Photosynthetica Vol 56 (en prensa).

Pedroche FF (2012) Clorobiontes. En: El Árbol de la Vida: Sistemática y evolución de los seres vivos. Pablo Vargas y Rafael Zardoya (Eds.) Madrid ISBN 97-84-615-9740-6.

Ruiz-Trillo I (2012) Eucariotas. En: El Árbol de la Vida: Sistemática y evolución de los seres vivos. Pablo Vargas y Rafael Zardoya (Eds.) Madrid ISBN 97-84-615-9740-6.

 

Jose A Hernandez Dic 2017RecJosé A. Hernández es Investigador Científico del Grupo de Biotecnología de Frutales (CEBAS-CSIC)


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ACLIMATACIÓN DE PLANTAS DE STEVIA A CONDICIONES EX-VITRO Y ESTUDIO DE SU RESPUESTA A SALINIDAD

 

El Grupo de Biotecnología de Frutales ha conseguido micropropagar y aclimatar plantas de Stevia rebaudiana y estudiar su respuesta  a salinidad en macetas.

La Stevia es un edulcorante natural no calórico que posee una capacidad endulzante unas 300 veces superior a la sacarosa. La producción a gran escala de Stevia se ve limitada en primer lugar por la baja germinación de sus semillas. En este sentido, en nuestro grupo, hemos desarrollado un protocolo para multiplicar las plantas de Stevia en condiciones in vitro con el fin de obtener plantas clonales.

Enraizamiento de plantas in vitro y aclimatación a condiciones ex-vitro

Estas plantas, adaptadas a condiciones ex vitro (en macetas) se sometieron a estrés salino y comprobamos que desarrollaban mecanismos de adaptación para crecer con salinidades de 2 y 5 g/L.  Entre dichos mecanismos observamos adaptaciones fisiológicas relacionadas con el desarrollo, acumulación de iones y fluorescencia de clorofilas. Por otro lado, también tenían lugar una serie de adaptaciones a nivel bioquímico como cambios en enzimas antioxidantes, contenido de clorofilas y prolina (aminoácido implicado en la tolerancia a estrés salino). Estos cambios les permiten sobrevivir en dichas condiciones de estrés ya que les permiten un ajuste osmótico, una protección de la fotosíntesis y una defensa frente al estrés oxidativo provocado por la salinidad.

Control                         2 g/l                           5 g/l

Efecto de la salinidad en el crecimiento de plantas de stevia y en la fluorescencia de clorofila (de arriba a abajo, qN, qP y NPQ).

En lo que a la producción de esteviósidos, hemos descrito un aumento con la edad de la planta de los contenidos del esteviósido que tiene mejores características comerciales, el Rebaudiósido A, lo que puede tener un interés comercial. Además, observamos que la salinidad no afectaba de una forma significativa la concentración del Rebaudiósido A.

Este trabajo demuestra que es posible usar aguas salinas u otras fuentes alternativas, como aguas de depuradora, para crecer estas plantas así como para la producción de este tipo de edulcorantes naturales.

Stevia La Verdad

Equipo Investigador

 

Para más información

Daniel Cantabella, Abel Piqueras, José Ramón Acosta.Motos, Agustina Bernal-Vicente, José A. Hernández, Pedro Díaz-Vivancos (2017) Salt-tolerance mechanisms induced in Stevia rebaudiana Bertoni: Effects on mineral nutrition, antioxidative metabolism and steviol glycoside content. Plant Physiol Biochem 115: 484-496. d.o.i.:10.1016/j.plaphy.2017.04.023.


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La Fotorrespiración: Un mecanismo de protección para la fotosíntesis en condiciones de estrés ambiental

José A. Hernández Cortés (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC, Murcia)

La RUBISCO (Ribulosa 1,5 bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa) tiene la capacidad de catalizar tanto la carboxilación (ciclo de Calvin-Benson) como la oxigenación de la Ribulosa 1,5-bifosfato (Miziorko y Lorimer 1983). Mientras que la carboxilación de la Ribulosa 1,5-bifosfato da lugar a dos moléculas de 3-fosfoglicerato, la oxigenación produce una molécula de 3-fosfoglicerato y otra de 2-fosfoglicerato. Este proceso de oxigenación de la Ribulosa 1,5 bifosfato se continúa con una serie de reacciones enzimáticas que tienen lugar en tres compartimentos celulares: cloroplastos, peroxisomas y mitocondrias. Por eso no es raro ver a estos tres orgánulos muy próximos el uno del otro en una célula vegetal en hojas (Fig 1). A este conjunto de reacciones se le conoce con el nombre de fotorrrespiración (o ciclo fotosintético C2 de oxidación del carbono) y ocurre fundamentalmente en las plantas denominadas C3 (Ogren 1984).

Fig. 1. Micrografía mostrando la cercanía de cloroplastos (C), peroxisomas (P) y mitocondrias (M) en una célula vegetal de una planta C3. Micrografía tomada en cooperación con el Dr. Enrique Olmos (CEBAS-CSIC)

Fig. 1. Micrografía mostrando la cercanía de cloroplastos (C), peroxisomas (P) y mitocondrias (M) en una célula vegetal de una planta C3. Micrografía tomada en cooperación con el Dr. Enrique Olmos (CEBAS-CSIC)

 

¿Qué funciones tiene la Fotorrespiración

El valor adaptativo de la fotorrespiración todavía es materia de debate para muchos fisiólogos vegetales. La fotorrespiración funciona al mismo tiempo que el Ciclo de Calvin-Benson y contribuye a un amplio rango de procesos en el cloroplasto, desde bio-energéticos hasta del metabolismo del C y de asimilación de N. Por ejemplo, el fosfoglicerato se incorpora directamente al Ciclo de Calvin-Benson, mientras que el fosfoglicolato se hidroliza para producir glicolato, que es metabolizado en mitocondrias y en peroxisomas. En el peroxisoma el glicolato se transforma en glicina, que posteriormente es descarboxilada en la mitocondria para producir serina, NH4+ y NADH:

Glicina serina

El NH4+ difunde hasta el cloroplasto donde se asimila para formar glutamina (a partir de glutamato), mientras que el NADH puede ser oxidado en la cadena de transporte electrónico de la mitocondria. La serina puede difundir al peroxisoma donde es convertida en glicerato, el cual pasa al cloroplasto para ser fosforilado y formar 3-fosfoglicerato que de nuevo entra en el ciclo de Calvin-Benson.

Como funciones más reconocidas para esta ruta cabe destacar:

1.- Se recupera carbono que podría perderse en forma de 2-fosfoglicerato al principio de la ruta. La fotorrespiración recupera un 75% del carbono perdido como glicerato que de nuevo puede entrar al Ciclo de Calvin-Benson. Es decir, 2 moléculas de 2-fosfoglicolato (4 C) que se pierden en la oxigenación de la Rubisco se transforman en una molécula de 3-fosfoglicerato (3 C). Esta conversión requiere la hidrólisis de una molécula de ATP. Además, la descarboxilación de la glicina en la mitocondria libera una molécula de CO2 que podría llegar al cloroplasto y ser fijada por la Rubisco y entrar en el Ciclo de Calvin.

2.- Otra función atribuida a la fotorrespiración es minimizar la foto-inhibición del aparato fotosintético causado por un exceso de poder reductor formado en el cloroplasto en condiciones de estrés ambiental (alta intensidad luminosa, elevada temperatura, déficit hídrico, salinidad, etc…). Cuando los aceptores electrónicos están saturados, el aparato fotosintético usa sustratos alternativos para eliminar el exceso de poder reductor generado por el flujo electrónico. La fotosíntesis en estas condiciones puede dar lugar a la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) que pueden ocasionar daños oxidativos al cloroplasto y a la célula. La fotorrespiración consume  O2 y ATP en el cloroplasto evitando su acumulación. El consumo de O2 en el cloroplasto minimiza su uso como aceptor de electrones en el PSI (reacción de Mehler) o que interaccione con moléculas de clorofila excitadas. Esto minimiza la formación de ROS.

3.- En el estroma del cloroplasto, la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa dependiente de ferredoxina (GOGAT) usan el NH4+ y el 2-oxoglutarato, para recuperar el N inicialmente perdido con el glutamato exportado desde el cloroplasto al peroxisoma. En estas reacciones se produce 2 moléculas de Ferredoxina oxidada (Fdox) y dos de ADP, que son empleadas como aceptores electrónicos en la cadena de transporte fotosintético.

En este sentido, la fotorrespiración disipa el exceso de equivalentes reducidos previniendo la sobre-reducción de la cadena de transporte fotosintético.

Cuando se produce un descenso en la relación CO2/O2 intracelular debido al cierre estomático, que se produce en respuesta a estrés hídrico o salino, se suele incrementar el flujo a través de la fotorrespiración.

Fig. 2.- La Fotorrespiración previene la sobre-reducción de la cadena de transporte electrónico en el cloroplasto. La ruta recupera el 75% del C perdido al principio en forma de fosfoglicolato. Además regenera aceptores electrónicos en la cadena de transporte fotosintético (Fdox y ADP) (Imagen tomada de Taiz y Zeiger 2006).

Fig. 2.- La Fotorrespiración previene la sobre-reducción de la cadena de transporte electrónico en el cloroplasto. La ruta recupera el 75% del C perdido al principio en forma de fosfoglicolato. Además regenera aceptores electrónicos en la cadena de transporte fotosintético (Fdox y ADP) (Imagen tomada de Taiz y Zeiger 2006).

 

Producción de H2O2 por la Fotorrespiración

En plantas C3 crecidas en condiciones que favorecen una elevada tasa de oxigenación de la Rubisco, tal como un día muy soleado, un estrés hídrico o salino, la ruta fotorrespiratoria es probablemente el proceso más importante y rápido en generar H2O2.

El H2O2 se forma en el peroxisoma durante la oxidación del glicolato a glioxilato por la enzima glicolato oxidasa. En esta situación, la enzima catalasa es crucial para eliminar el H2O2 generado en la fotorrespiración.glicolato oxidasa catalasa

La importancia de la catalasa para realizar esta función se ha demostrado con plantas mutantes que presentan baja actividad catalasa o empleando la tecnología antisentido (plantas transformadas con un gen que codifica para la catalasa pero insertado a la inversa provocando así la ausencia del correspondiente mRNA, por lo que no se sintetiza la proteína). Además, se ha demostrado que la catalasa es importantísima para mantener el balance redox celular en condiciones de estrés oxidativo (alta intensidad luminosa, salinidad, ozono etc…) (Willekens et al. 1997).

Aunque los peroxisomas contienen todos los componentes del ciclo ascorbato-glutatión (ASC-GSH) (Jiménez et al., 1997) no es capaz de eliminar la gran cantidad de H2O2 generado en el peroxisoma cuando hay un alto flujo fotorrespiratorio. Sin embargo, una de las funciones atribuidas al ciclo ASC-GSH en el peroxisoma es eliminar el H2O2 que podría difundir por la membrana del peroxisoma y evitar un estrés oxidativo en el citosol (Jiménez et al., 1997, 1998).

La catalasa es un hemoproteína con una alta actividad pero con una baja afinidad (alta Km) por el H2O2. Actúa con altas concentraciones de H2O2, mientras que la APX posee una alta afinidad (baja Km), por lo que es muy activa con bajos niveles de H2O2, actuando en la regulación fina de los niveles intracelulares de H2O2. Esto quiere decir que la eliminación de H2O2 por la catalasa requiere altas concentraciones de esta enzima, mientras que la eliminación por APX requiere menos niveles de enzima. Los altos niveles de enzima catalasa requeridos para esta función se reflejan en los grandes cristales de catalasa que se pueden observar en fotografías de peroxisomas tomadas con microscopio electrónico (Fig 3).

Fig 3. Micrografía mostrando los tres orgánulos implicados en la fotorrespiración, donde se aprecia la localización de la catalasa en la matriz del peroxisoma como una inclusión de forma cuadrada. Imagen sacada del libro “Plant Peroxisomes” (Huang et al, 1983). C, cloroplasto, m , mitocondria, P, peroxisoma).

Fig 3. Micrografía mostrando los tres orgánulos implicados en la fotorrespiración, donde se aprecia la localización de la catalasa en la matriz del peroxisoma como una inclusión de forma cuadrada. Imagen sacada del libro “Plant Peroxisomes” (Huang et al, 1983). C, cloroplasto, m , mitocondria, P, peroxisoma).

 

La generación de H2O2 en la fotorrespiración puede incluso ser mayor que el generado en la reacción de Mehler-peroxidasa (Foyer y Noctor 2003) (ver también https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2015/10/06/funcion-del-ascorbato-en-la-proteccion-de-la-fotosintesis-i-la-reaccion-de-mehler-y-el-ciclo-agua-agua/).

Existe una fuerte correlación entre  los niveles de actividad catalasa y la tasa fotosintética. La inhibición de la actividad catalasa con el inhibidor aminotriazol hace disminuir la tasa de asimilación de CO2 (Amory et al., 1992). Esto podría ser debido a que el H2O2 es un inhibidor de enzimas que están reguladas por el sistema tiorredoxina como ocurre con algunas enzimas del Ciclo de Calvin-Benson (Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Fructosa-1,6-bisfosfatasa, Sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa, Fosforibuloquinasa….) (Jacquot et al (1993).

La inhibición de la actividad catalasa puede producirse en condiciones de estrés que afecten a la síntesis de proteínas (salinidad, estrés hídrico, altas y bajas temperaturas etc….) (Vock y Feierabend 1989). Esto tendría un efecto inmediato de acumulación de H2O2 en el peroxisoma, que podría difundir a través de la membrana de este orgánulo y afectar a otros compartimentos celulares.

Conclusiones

Como hemos comentado anteriormente, las funciones adscritas a la fotorrespiración sigue siendo un tema de debate. Cuando se describió este conjunto de reacciones no se le pudo asignar ninguna función útil a la fotorrespiración por diferentes motivos (ver Figura 4):

1.- Se pierde ribulosa-1,5-bisfosfato para el ciclo de Calvin-Benson

2.-La fijación de CO2 se invierte: se consume O2 y se libera CO2 en presencia de luz (de ahí el  nombre de fotorrespiración).

3.-Sólo una parte del carbono se recicla

4.- Gasto de ATP de forma innecesaria.

Figura 4.- Flujo del carbono y del oxígeno en el ciclo de Calvin y en la fotorrespiración. (Imagen tomada de Taiz y Zeiger 2006).

Figura 4.- Flujo del carbono y del oxígeno en el ciclo de Calvin y en la fotorrespiración. (Imagen tomada de Taiz y Zeiger 2006).

 

Se consideró que la fotorrespiración era una ruta metabólica residual, ineficaz e incluso inútil. Era como si la fotorrespiración deshiciera lo realizado por la fotosíntesis. Pero investigaciones posteriores pusieron de manifiesto que tanto la fotorrespiración como la fotoinhibición (interrupción controlada del PS II) son muy importantes para la regulación de la fotosíntesis. De hecho, mutantes incapaces de hacer fotorrespiración no son capaces de crecer en  condiciones ambientales normales, o la supresión del proceso por manipulación genética produce desequilibrios en la planta.

Por tanto, con el paso del tiempo diferentes investigaciones han ido atribuyendo a la fotorrespiración un efecto protector para el proceso de fotosíntesis. Por ejemplo, en situaciones donde la concentración del CO2 es baja. Esta situación ocurre cuando las plantas están creciendo en condiciones de alta intensidad luminosa, cuando hay limitaciones hídricas, salinidad etc… En tales situaciones, un descenso en el proceso de asimilación de CO2 no permitiría una regeneración de los aceptores de electrones en la cadena de transporte fotosintético, especialmente NADP+ y ADP, lo que favorecería la generación de ROS.  En estas condiciones, la fotorrespiración es un sumidero alternativo de energía o de poder reductor (Arellano y De la Rivas 2006). Consume, como hemos visto, O2 y ATP en el cloroplasto evitando su acumulación. El consumo de O2 en el cloroplasto minimiza su uso como aceptor de electrones en el PS I (reacción de Mehler; ver también https://cienciacebas.wordpress.com/2015/10/06/funcion-del-ascorbato-en-la-proteccion-de-la-fotosintesis-i-la-reaccion-de-mehler-y-el-ciclo-agua-agua/) o que interaccione con moléculas de clorofila excitadas. Esto minimiza la formación de ROS. Además, permite un flujo electrónico que favorece la recuperación de C para el Ciclo de Calvin-Benson y de aceptores electrónicos (Fdox y ADP).

Es cierto que la fotorrespiración reduce la eficiencia fotosintética (Arellano y De la Rivas 2006), pero ofrece a cambio un mecanismo de fotoprotección en condiciones adversas que opera junto a otros mecanismos de protección, como el ciclo agua-agua y el ciclo de las xantofilas (ver también https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2015/10/06/funcion-del-ascorbato-en-la-proteccion-de-la-fotosintesis-i-la-reaccion-de-mehler-y-el-ciclo-agua-agua/ y https://antioxidantsgroup.wordpress.com/2015/10/13/funcion-del-ascorbato-en-la-proteccion-de-la-fotosintesis-ii-los-carotenoides-y-el-ciclo-de-las-xantofilas/).

En consequencia, la Rubisco, enzima sumidero de CO2 o de O2 garantiza un consumo de ATP y NADPH bien mediante el ciclo fotorreductor del carbono (ciclo de Calvin-Benson) o mediante el fotooxidativo (fotorrespiración) (Arellano y De las Rivas 2006).

 

Bibliografía

Arellano y De las Rivas (2006) Investigación y Ciencia Marzo, pp. 42-50.

Amory et al (1992) Plant Cell Environm 15: 655-663.

Foyer y Noctor (2003) Physiol Plant 119: 355-364.

Huang AHC, Trelease RN, Moore TS Jr (1983) Plant Peroxisomes. Academic Press Inc., New York

Jacquot et al (1993) New Phytol 136: 543-570.

Jiménez et al (1997) Plant Physiol 114: 275-284

Miziorko y Lorimer (1983) Ann. Rev. Biochem. 52:507-535.

Ogren (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35:415-422.

Taiz y Zieger (2006) Fisiología Vegetal, tercera Edición. Servicio de Publicaciones de la Universidad Jaime I, Castellón (España).

Vock y Feierabend (1989) Plant Cell Environm 12:701-712.

Willekens et al (1997) EMBO J. 16 : 4806-4816.

JA Hernandez

José A. Hernández Cortés es Investigador Científico en el CEBAS-CSIC


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FUNCION DEL ASCORBATO EN LA PROTECCIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS: (II) Los carotenoides y el ciclo de las Xantofilas

José A. Hernández Cortés y Pedro Díaz Vivancos (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC)

Los carotenoides, además de servir como pigmentos accesorios, cumplen una función esencial en la fotoprotección de la maquinaria fotosintética. Los mecanismos de fotoprotección actúan como válvulas de seguridad, eliminando o liberando el exceso de energía antes de que pueda dañar a la planta.

Cuando la energía almacenada en las moléculas de clorofila en estado excitado se disipa rápidamente (mediante transferencia de excitación o fotoquímica) se dice que ese estado excitado está capturado (en inglés “quenched”) (Fig. 1). En castellano, el vocablo quenched significa apagado, aplacado, sofocado, calmado, extinguido, mitigado….. Si el estado de excitación de las clorofilas no es extinguido mediante transferencia fotoquímica (a través de la cadena de electrones) puede reaccionar con el oxígeno molecular (O2 ) y formar un estado excitado de esta molécula denominado oxígeno singlete (1O2) (Fig. 1). Esta forma activada del O2 puede reaccionar con cualquier componente celular, especialmente con los lípidos de las membranas celulares (Taiz y Zeiger 2010).

Los carotenoides ejercen su acción fotoprotectora mediante la captura del estado excitado de las clorofilas. El estado excitado de los carotenoides no tiene suficiente energía como para transferirla al O2 (por lo tanto no se forma 1O2), de modo que este estado excitado de los carotenoides decae hasta su estado fundamental perdiendo la energía en forma de calor (Fig. 1).

Fig 1 para ciclo X

Fig. 1.-  A: Condiciones donde toda la energía absorbida por la clorofila (Chl) es usada para la fotosíntesis. B: Condiciones de estrés lumínico donde sólo una parte de la energía absorbida por la Chl es usada para hacer fotosíntesis. En este último caso, para te la energía de excitación puede ser transferida al O2 para formar oxígeno singlete (1O2). El exceso de energía puede ser disipado de una forma segura en procesos fotoprotectivos en presencia de Zeatina a pH ácido en el interior de las membranas de los tilacoides con el fin de prevenir la formación de 1O2 . En este caso, la energía de la Chl excitada se puede usar para procesos fotoquímicos o bien se puede perder de forma segura en forma de calor. Modificado a partir de Demming-Adams y Adams (1996).

 

 

Se denomina quenching no fotoquímico (NPQ) a la captura de la fluorescencia de las clorofilas por procesos diferentes a los fotoquímicos. Gracias a los procesos de NPQ, una fracción importante de la energía de excitación de los sistemas antena causado por un estrés lumínico es capturado (quenched) y convertido en calor (Baker 2008). En este sentido, el NPQ está implicado en los mecanismos de protección de la maquinaria fotosintética cuando se produce una sobreexcitación, protegiendo de los posibles daños derivados. Los mecanismos moleculares del NPQ no están del todo dilucidados y se sugiere que hay varios procesos de quenching. El pH del lumen tilacoidal y el estado de agregación de los complejos antena son factores importantes. Además, se sabe que tres carotenoides, denominados xantofilas, están implicados en este mecanismo de NPQ: La violaxantina (V), la anteroxantina (A) y la zeaxantina (Z) (Taiz y Zeiger 2010).

En condiciones de alta iluminación (o debido a otro tipo de estrés que cause una limitación en la fijación de CO2 como la sequía o salinidad), la V es convertida a Z, pasando por el intermedio A, por acción de la enzima Violaxantina de-epoxidasa (VDE) en una reacción dependiente de ascorbato (ASC). A este conjunto de reacciones se le conoce como Ciclo de las Xantofilas (Fig. 2), implicado en la disipación del exceso de energía luminosa en forma de calor en las hojas.

Cuando el estrés desaparece o se reduce, el proceso se revierte (paso de Z a A). En este proceso se consume NADPH, generando NADP+, el aceptor final de electrones de la cadena de transporte. Por lo tanto, volvemos a encontrarnos con el ASC mediando una función protectora de la maquinaria fotosintética.

La unión de los protones y de la Z a las proteínas de las antenas colectoras de luz en los tilacoides, causan cambios conformacionales que conducen a la captura de energía y a la disipación en forma de calor (Demming-Adam y Adams 1992).

 

La deficiencia de ASC limita el ciclo de las Xantofilas

Como hemos comentado anteriormente, en respuesta a una alta intensidad luminosa (y a otros estreses, que pueden ir combinados), las plantas ponen en marcha mecanismos que les permiten disipar el exceso de luz absorbida en forma de calor. Uno de estos mecanismos es el NPQ, que requiere de la conversión de V a Z, por acción de la enzima VDE. Esta enzima se localiza en el lumen de los tilacoides, se activa a pH ácido (aprox 6.5, con una actividad máxima a pH 5) y necesita ASC como poder reductor (donador de electrones). Para comprobar la importancia fisiológica del ASC para el proceso de NPQ se han realizado experimentos empleando mutantes de Arabidopsis que contienen bajos niveles de ASC, como el mutante vtc, que contiene un 25% de los niveles de ASC que contienen las plantas silvestres. Cuando las plantas se crecen en presencia de una alta intensidad luminosa (1500 µmoles fotones m-2 s-1) los mutantes presentaron valores más bajos de NPQ, pero valores similares de ETR (tasa de transporte electrónico). Este menor NPQ era paralelo a una menor tasa de conversión de A a Z medido en tilacoides aislados. Cuando se aplicaba ASC a las hojas o a preparaciones de tilacoides se rescataba el fenotipo mutante, ya que se conseguía un aumento en NPQ y en los niveles de Z estableciéndose una unión clara entre ASC, Z y NPQ (Müller-Moulé et al., 2002).

 

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés)  en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

Fig 2. Ciclo de las Xantofilas. Conversión de violaxantina (V) en zeaxantina (Z) en condiciones de estrés lumínico (o por efecto de otro tipo de estrés) en una reacción dependiente de ASC. Cuando el estrés cesa, el paso de Z a V requiere NADPH generando NADP+, el aceptor final de la cadena de transporte de electrones.

 

La susceptibilidad a estrés oxidativo mostrado por los mutantes deficientes en ASC se puede explicar no sólo por su reducida capacidad antioxidante sino también por presentar un ciclo de las xantofilas menos activo, reflejado por reducidos niveles de NPQ.

La relación ASC-NPQ también se ha demostrado empleando mutantes que sobreproducen ASC (mutante miox4), que presentan altos valores de NPQ (Tòth et al., 2011). Por otro lado, se ha demostrado también una función importante de la enzima deshidroascorbato reductasa (DHAR, enzima que recicla el ASC) en el proceso de NPQ, ya que la supresión de la expresión de esta enzima daba lugar a bajos valores de NPQ y a un aumento de los contenidos de especies reactivas del oxígeno (ROS) con tratamientos de estrés lumínico (Chen y Gallie 2008).

Conclusiones

El ciclo de las Xantofilas constituye un mecanismo de defensa para proteger a la fotosíntesis (y por tanto al cloroplasto) que permite la eliminación del exceso de energía en forma de calor de forma segura. La acción de este ciclo previene la formación de 1O2 evitando daños oxidativos. Como podemos comprobar, de nuevo el ASC es una pieza importante en el mecanismo de acción de este ciclo, ya que en su ausencia se produce un descenso en los procesos de quenching no fotoquímico (NPQ).

Referencias

  • Baker NR (2008) Annu. Rev. Plant Biol. 59: 89-113.
  • Chen y Gallie (2008) J. Biol. Chem. 283: 21347-21361.
  • Demming-Adam and Adams (1992) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 43: 599-626.
  • Demming-Adam and Adams (1996) Trend in Plant Sci 1: 21-26
  • Müller-Moulé et al (2002) Plant Physiol 128: 970-977
  • Taiz y Zieger (2010) Plant Physiology, Fifth edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA. ISBN 978-0-87893-866-7.
  • Tôth et al (2013) Physiol Plant 148: 161-175.


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FUNCION DEL ASCORBATO EN LA PROTECCIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS: (I) La reacción de Mehler y el ciclo agua-agua

José A. Hernández Cortés y Pedro Díaz-Vivancos (Grupo de Biotecnología de Frutales, CEBAS-CSIC)

El ascorbato (ASC, también llamado Vitamina C) es una molécula multifuncional en las plantas. La mayoría de las funciones biológicas del ASC derivan de su capacidad para actuar como un agente reductor (es decir, que cede electrones a otras moléculas). Esta capacidad hace del ASC una molécula antioxidante muy eficaz.

Además de su papel como antioxidante, el ASC puede participar en otras funciones, como en el desarrollo celular, en la síntesis de la pared celular, modula la síntesis de algunas fitohormonas (ácido abcísico, giberelinas, etileno, ácido salicílico), participa en el control del movimiento de los estomas (https://cienciacebas.wordpress.com/2013/12/12/regulacion-del-cierre-estomatico-una-funcion-representada-por-varios-actores/), interviene en la acumulación de antocianos durante la aclimatación a alta intensidad luminosa, etc…

Sin embargo, en esta entrada vamos a centrarnos en la función(es) del ASC en el cloroplasto como un protector de la maquinaria fotosintética.

Función antioxidante del ASC en el estroma del cloroplasto

El ASC, junto con el glutatión (https://cienciacebas.wordpress.com/2013/04/03/glutation-una-molecula-para-todo/), participa en la eliminación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en el denominado ciclo agua-agua (Asada 1999). Este ciclo comienza con la denominada reacción de Mehler. La reducción del oxígeno molecular (O2) hasta superóxido y H2O2 por los electrones de la cadena de transporte electrónico fotosintético en el PSI se denomina “Reacción de Mehler” (Mehler 1951) (Fig. 1).

Fig. 1. Reacción de Mheler. PS, fotosistema; SOD, superóxido dismutasa.

Fig. 1. Reacción de Mehler. PS, fotosistema; SOD, superóxido dismutasa.

Años más tarde, el profesor Kozy Asada describió el denominado ciclo agua-agua, esto es la fotorreducción del O2 hasta agua en el PSI empleando los electrones procedentes de la fotólisis del agua en el PSII (Asada, 1999, 2006). Este ciclo incluye la reacción de Mehler, es decir, comienza con la fotólisis de la molécula de agua en el PSII, la fotorreducción del O2 para producir radicales superóxido (O2.- ) en el PSI y la dismutación del O2.- hasta H2O2 por acción de la isoenzima Cu,Zn-SOD unida a tilacoides.

El ciclo agua-agua continúa con la reducción del H2O2 hasta agua por la acción de la enzima ascorbato peroxidasa (APX). Esta reacción puede ocurrir tanto en el tilacoide como en el estroma, ya que parte del H2O2 producido puede difundir al estroma del cloroplasto. En esta reacción, la APX usa el ASC como donador de electrones para reducir el H2O2 hasta agua generando radicales monodeshidroascorbate (MDHA).APX

A continuación, el MDHA generado tiene que ser reducido para regenerar el ASC. Esta reacción puede ocurrir de dos formas:

Bien puede ocurrir de forma espontánea vía ferredoxina reducida (Fdred) en el PSI,

Mono espontanea

o bien mediante la reacción de la enzima monodeshidroascorbato reductasa (MDHAR) en el estroma del cloroplasto:

MDHAR

Además, el MDHA puede desproporcionar directamente para producir ASC y deshidroascorbato (DHA), que puede difundir al estroma, donde es reducido hasta ASC por acción de la enzima deshidroascorbato reductasa (DHAR), en una reacción dependiente de GSH (glutatión reducido) generando glutatión oxidado (GSSG). A continuación el GSH es regenerado a partir de GSSG por acción de la enzima glutatión reductasa (GR) que emplea NADPH como poder reductor:

DHAR y GR

Como podemos ver en estas reacciones, el ciclo agua-agua proporciona aceptores electrónicos para el PSI, es decir, Fdox y NADP+.

Fig. 2 Esquema del Ciclo Agua-agua (desarrollado a partir del ciclo agua-agua descrito por Asada (1999).

Fig. 2 Esquema del Ciclo Agua-agua (desarrollado a partir del ciclo agua-agua descrito por Asada (1999).

En el esquema del ciclo agua-agua (flechas azul marino) podemos observar que la mitad de los electrones derivados de la fotólisis del agua en el PSII son utilizados para la reducción del O2 hasta O2.-, mientras que la otra mitad se emplean para regenerar las moléculas reductoras (el ASC) que se emplean para reducir el H2O2 hasta agua.

Funciones de la Reacción de Mehler y del ciclo agua-agua

La generación de ROS en el cloroplasto está influida por factores fisiológicos y ambientales, de modo que esta tasa aumenta cuando el flujo de intensidad luminosa está en exceso del requerido para la fijación de CO2 (Asada 1999, 2006). La fotoproducción y eliminación de ROS no sólo protege al cloroplasto de los efectos dañinos de dichos ROS sino que también actúa como una válvula de escape para el exceso de fotones. En este sentido el ciclo agua-agua cumple una serie de funciones de protección:

 

1.- Ajuste de la relación ATP/NADPH

El ciclo agua-agua (incluyendo la reacción de Mehler) proporciona un flujo lineal de electrones favoreciendo la generación de un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide, lo que permite la síntesis de ATP que no es consumido en el ciclo agua-agua (a esta producción de ATP se le denomina fotofosforilación pseudocíclica). Por lo tanto, permite un aumento del ratio ATP/NADPH en el cloroplasto. Una alta relación ATP/NADPH favorece la ruta fotorrespiratoria, por lo que podemos decir que el ciclo agua-agua aporta ATP adicional para la fotorrespiración.

2.-Protección frente a las ROS

Si el ciclo no fuese activo, tanto O2.- como H2O2 difundirían al estroma y oxidarían moléculas diana en el cloroplasto. En presencia de metales de transición (Fe, Cu), liberados de las proteínas, se podría catalizar la generación de radicales hidroxilo (.OH). La acumulación de H2O2 podría inhibir la APX en ausencia de ASC. La fijación de CO2 se inhibe hasta un 50% en presencia de 10 µM de H2O2 (Kaiser 1976). Además, el H2O2 es un inhibidor de las enzimas CuZn-SOD, Fructosa 1,6-bifosfatasa; Ribulosa 5 fosfato Kinasa, gliceraldehído-3-P- deshidrogenasa, sedoheptulosa 1,7-bisfosfatasa.

El radical O2.- inhibe enzimas que contiene grupos 4Fe-4S (como aconitasa o 6-fosfogluconato dehidratasa), mientras que los radicales .OH inhiben las enzimas glutamato sintasa y Rubisco.

3.- Disipación del exceso de fotones en condiciones de estrés

El ciclo agua-agua induce y mantiene la denominada “down-regulation” del PS II (una bajada de la actividad del PSII) mediante la generación de un gradiente de protones. Este gradiente de protones es importante para la formación de zeatina en el lumen de los tilacoides (este mecanismo lo veremos en una siguiente entrada “ciclo de las xantofilas” en el que el ASC tiene también una función importante).

Además, el ciclo puede disipar el exceso de fotones utilizando el O2 como aceptor de electrones generando H2O sin producirse la liberación de O2.- ni de H2O2 incluso si los aceptores electrónicos fisiológicos no están disponibles.

 

CONCLUSIONES

  • El ASC tiene un papel fundamental en la eliminación del H2O2 generado en la reacción de Mehler.
  • El ciclo Agua-Agua regenera aceptores electrónicos cono la Fdox y NADP+. Este último es el aceptor final preferido en la cadena de transporte.
  • El ciclo Agua-Agua genera ATP que puede ser utilizado en el Ciclo de Calvin-Benson o en la ruta fotorrespiratoria.
  • El ciclo Agua-Agua actúa como una válvula de escape permitiendo disipar el exceso de fotones en condiciones de estrés ambiental.

 

Referencias

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